| 研究課題/領域番号 |
25713040
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
山澤 一樹 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (10338113)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | エピジェネティクス / ゲノムインプリンティング / 先天異常症候群 / メチル化 |
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| 研究実績の概要 |
シトシン塩基（C）のメチル化は最も詳細に解析されているゲノムのエピジェネティック修飾である。また近年、ゲノムDNA中に存在が確認されたヒドロキシメチル化シトシン（5hmC）は、メチル化シトシン（5mC）の酸化産物である。5mC→5hmC→Cという脱メチル化カスケードの存在が証明されたことから、5hmCはDNA脱メチル化機構の中間代謝産物であると考えられ、「第6のDNA塩基」として注目されている。
本年度は、酸化バイサルファイト法（oxBS）を用いて、5hmCの分布を一塩基レベルの解像度でゲノムワイドに解析する実験系を確立した。Pilot studyとして、IG-DMRの高メチル化のエピ変異により発症したKagami-Ogata症候群（KOS14）患者の末梢血DNAを用い、oxBS処理サンプルをサブクローニングおよびパイロシークエンスにより解析し、IG-DMRにおける5mCおよび5hmCの分布を正常コントロールと比較検討した。引き続いて、同サンプルをメチル化解析用ビーズチップを用いて5mCおよび5hmCの分布をゲノムワイドに解析した。
解析の結果、KOS14患者末梢血DNAに特徴的な5hmCの分布パターンは認められず、エピ変異を生じたIG-DMRやその他のインプリンティングセンターにおいても5hmCはほとんど検出されなかった。一方で、コントロールとして解析した正常人脳サンプルには5hmCが多量に含まれていた。来年度は神経系に注目し、KOS14患者由来のiPS細胞から分化した神経細胞を用いて同様の解析を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初予定していた免疫沈降法に代わり、oxBS法を用いた解析を用いることにより、一塩基レベルの解像度で5hmCの同定が可能となった。このoxBS法にビーズチップを組み合わせることで、ゲノムワイドに5hmCを検出することが可能となった。しかしながらoxBS法やビーズチップは高価であること、DNA収量が減少することが問題である。来年度はこれまで集積してきたKOS14以外のインプリンティング異常症例についても同様の解析を行う。総じて、研究計画はおおむね順調に推移している。
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| 今後の研究の推進方策 |
5hmC解析の実験系構築に成功し、KOS14の末梢血DNAでは特徴的な5hmCの分布パターンは確認できないことを見出した。来年度はKOS14以外の多数のインプリンティング異常症例末梢血DNAに対して同様の解析を行う。
一方で脳には5hmCが多く含まれることが確認され、またインプリンティング異常疾患では発達遅滞が必発であることから、神経系の解析が重要であると思われる。我々はKOS14患者由来のiPS細胞を既に複数ライン樹立しており、これを神経細胞に分化させて、今回構築した実験系による解析を行う。またoxBS法と次世代シークエンサーによる解析を進め、"hydroxymethylome"を明らかにすることを試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は研究補助員を雇用せず、予定していた人件費に余剰が生じたため。また主に実験系の構築や条件検討に注力し、大量に検体を処理するステップには至らず、物品費が想定よりも少額であったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
oxBS法およびビーズチップ共に非常に高価であり、充分な予算充当が必要である。またiPS細胞の分化誘導を行っており、培養試薬やディスポーザブル器具の購入に際しても予算確保が必要である。さらに次世代シークエンサーを用いた網羅的解析にも予算を確保する。
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