| 研究課題/領域番号 |
25713050
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| 研究種目 |
若手研究(A)
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
仲田 興平 九州大学, 大学病院, 助教 (30419569)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | オートファジー / 癌幹細胞 / 癌 |
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| 研究概要 |
膵臓癌を代表とする難治性固形腫瘍は早期から浸潤、転移を生じ発見時に既に治癒切除が困難である事が多い。その多くが放射線照射、化学療法抵抗性であり治療抵抗性である。近年、乳癌、膵臓癌、脳腫瘍などの固形癌において血液腫瘍同様に、癌幹細胞の存在の可能性が示唆され、注目を集めている。癌幹細胞は正常幹細胞同様に細胞周期を静止期(G0)に維持する事により癌組織を維持しているが現在使用されている抗癌剤の多くは、細胞分裂中のDNAに入り込み、DNA合成阻害により癌細胞の増殖を抑えているため静止期に留まっている癌幹細胞に対して既存の化学療法は効果が無い。そのため、癌細胞の再発を防ぐには癌幹細胞の静止期維持機構を解明し、癌幹細胞の治療抵抗性を改善する方法の開発が急務である。オートファジーは細胞内の代謝に不可欠なシステムであるが、発癌から転移、浸潤、化学療法抵抗性まで癌の様々な局面に重要な役割を果たしていることが明らかになった。近年、血液幹細胞の維持にオートファジーの関与が初めて報告され、幹細胞の静止期維持機構に関与している可能性が示唆されたが、固形癌幹細胞静止期維持機構とオートファジーに関する報告は皆無である。本研究では癌幹細胞維持に必要な静止期維持機構にオートファジーが関与している事を確認し、さらに、人工ウイルスを用いて細胞選択的に治療薬を投与する新規Drug Delicery Systemの開発を行う。
①手術標本組織からの癌幹細胞の純化および純化細胞の癌幹細胞としての能力の証明
②幹細胞、非幹細胞集団での形態、細胞周期、オートファジー誘導、遺伝子発現の違いを検討
③幹細胞へのオートファジー抑制による静止期分化誘導の検証
④オートファジー抑制に基づく幹細胞分化誘導およびその後の抗癌剤治療効果改善の検討
⑤マウスモデルにおける人工ウイルスを利用した新規DDSを用いた細胞特異的治療法の検討
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1. 手術標本組織からの癌幹細胞の純化
幹細胞マーカーとして期待されるCD133陽性分画およびCD44陽性分画に関して解析をすすめた。これらの分画中に膵癌癌幹細胞が含まれると期待する。細胞集団を手術切除標本からセルソーターで純化、細胞浮遊液を作成した。
現時点で明らかなCD133、CD44細胞分画の確立は未達成であるが、代替手段としてKPCマウスから自然発生した腫瘍から同様の方法を行う事を試みる。現在我々はKPCマウスより自然発生した癌細胞株の樹立に成功しており、これを利用し幹細胞群の純化を試みる予定である。
また、当研究室に保存している癌細胞株からも同様の手段でソーティングを行い幹細胞集団と思われる集団の純化を試みる。
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| 今後の研究の推進方策 |
1.純化した細胞集団を新規免疫不全マウスに移植し、腫瘍形成能や多分化能、腫瘍再現能などを評価する。さらに２次移植を行い癌幹細胞としての能力を証明する。
2.幹細胞集団とそれ以外の集団における抗癌剤や放射線への感受性、さらに固形癌特有である浸潤・転移能、またこれらの能力に関連する分子発現を検討するin vitroにおいて検討し、幹細胞、非幹細胞集団での形態、細胞周期、オートファジー誘導、遺伝子発現の検討、純化された細胞集団が癌幹細胞である事が確認できたら、細胞群でオートファジー誘導の違いを確認する。確認方法には蛍光免染、ウエスタンブロット、電子顕微鏡を用いて行う。
3.幹細胞集団におけるオートファジー抑制後の静止期分化誘導発生の検証
オートファジーを抑制する事による細胞周期を含めた幹細胞特性の変化を確認する。
上記計画で作製、純化した膵癌幹細胞に対してオートファジー関連遺伝子Atg5、Atg7のノックダウンもしくはオートファジー抑制剤3MAを添加して行う。ノックダウン後にCD133細胞を発現する細胞の割合の変化をFACSにて確認する。幹細胞は細胞周期から離脱し、静止期(G0期)に維持されている。この幹細胞集団はオートファジー抑制剤投与後には分裂期(S期)に移行する事が考えられる。さらに幹細胞群に対してコントロール群とオートファジー抑制群に分け、抗癌剤耐性、放射線耐性の変化を検討する。オートファジー抑制により幹細胞の分化誘導がみられ治療耐性が改善する事が考えられる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
研究1年目としては順調に遂行されていると考えられるが、固形癌幹細胞集団は未だ確固たる報告が無く、幹細胞群あるいは幹細胞類似集団が実際に存在する事の証明を多面的に行う必要がある。非常に有望な仮説ではあるが同時に困難を極める事も予想されている。今後更に本課題を遂行していく必要がありその為に経費が必要とされている。我々は本研究に関連しオートファジーと癌微小環境の関連も解明する事にしており有望な結果を認めている。
試薬類30万円、抗体50万円、リボ核酸干渉・遺伝子強制発現200万円、実験用マウス60万円、実験用ガラス器具25万円
研究成果発表費 20万円、論文投稿料20万円
遺伝子改変マウス作成料200万円
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