| 研究課題/領域番号 |
25750064
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| 研究機関 | 千里金蘭大学 |
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研究代表者 |
小林 優子 千里金蘭大学, 生活科学部, 助教 (10393208)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | カルシウム吸収 / 腸管上皮細胞 / Caco-2 / 精油 |
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| 研究実績の概要 |
現代の日本人において、カルシウム摂取の慢性的な不足が問題となっている。本研究では、カルシウム吸収の第一段階をになう腸管上皮細胞を用いて、カルシウム吸収促進効果を簡便に判定するスクリーニング系を構築すること、そしてこの系を利用して、腸管に作用してカルシウム吸収を促進する新たな機能性成分を見出すことを目標としている。
平成27年度は、前年度に引き続き、腸管上皮培養細胞であるヒト結腸癌由来細胞株Caco-2を用いたスクリーニングの条件設定を行った。本研究では、Caco-2の細胞内カルシウム濃度変化を指標としたスクリーニングを実施することを予定している。その測定条件を決定するため、カルシウム蛍光指示薬を負荷したCaco-2細胞の蛍光変化を蛍光顕微鏡下で観察し、蛍光指示薬の種類や負荷の方法について検討した。その結果、蛍光指示薬Fluo-4が測定に適していると判断した。また、細胞を培養する際に、カルシウム吸収を促進する成分として既に知られている活性型ビタミンDを添加した場合、蛍光強度に変化が出るかを比較検討した。よりはっきりとした変化が検出できる条件を現在検討中である。また、本研究では、機能性成分の候補として植物由来の精油に着目している。スクリーニング実験に先立って、精油がCaco-2細胞の増殖に与える影響を調べた。さまざまな精油をCaco-2細胞の培養上清に添加し、細胞増殖をMTTアッセイにより検討した結果、精油の種類により効果は異なっており、低濃度で添加しても細胞増殖が低下する精油や、逆に細胞増殖を亢進させる精油があることが分かった。今後、スクリーニングに用いる際には、細胞増殖に影響を与えない濃度で用いることが重要である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成27年度の研究実施計画と照らし合わせると、腸管上皮培養細胞を用いた蛍光測定の条件設定ならびに精油が細胞に与える影響の検討はおおむね順調に進んでいるといえる。使用するカルシウム蛍光指示薬の種類や、負荷方法の検討に時間を要したため、蛍光プレートリーダーを用いての測定がまだ開始できていないので、蛍光測定の条件設定が整い次第着手する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度に引きつづき、蛍光測定による細胞内カルシウム濃度変化を指標としたスクリーニング系の条件設定を行う。系の準備が整い次第、カルシウム吸収を促進する精油の探索を開始する。これにより、カルシウムの経細胞輸送経路を活性化する成分の探索を行うことができる。
さらに、カルシウム吸収のもうひとつの経路である細胞間輸送経路の活性化因子を探索するために、細胞間隙の蛍光色素透過量とTER（経上皮電気抵抗）値を指標としたスクリーニング系の開発を開始する。具体的な方法としては、コラーゲンコートした透過性膜を持つインサート上に培養したCaco-2細胞を用いて、細胞間隙を透過した蛍光色素の量を蛍光プレートリーダーにより測定し、物質透過量として算出する。ポジティブコントロールとして活性型ビタミンDを用い、インサート内に事前に添加した場合とそうでない場合の測定値を比較する。使用する蛍光色素の種類や添加濃度、インキュベート時間等を検討し、活性型ビタミンDの有無で有意に差が出る条件を決定し、カルシウム吸収効率が判定できる条件を設定する。この際、TER（経上皮電気抵抗）の測定も行い、イオン透過性の状態変化を判断する指標とする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた理由は、平成27年度中に実施予定であった、蛍光プレートリーダーを用いての測定が行えなかったため、この実験に使用する予定の細胞培養用プラスチック器具や関連試薬の購入のための費用が支出されなかったことによる。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額は、平成28年度直接経費とあわせ、細胞培養用プラスチック器具、細胞培養用試薬、カルシウム蛍光指示薬などの購入に利用する予定である。
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