| 研究課題/領域番号 |
25750390
|
|---|
| 研究機関 | 福岡大学 |
|---|
研究代表者 |
福田 将虎 福岡大学, 理学部, 助教 (90526691)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| キーワード | RNA編集 / 機能性RNA / ADAR / 分子設計 / 部位特異的変異導入 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究は、生体内A-to-I RNA編集機構を利用し、標的RNA上の任意の部位に特異的かつ効果的に変異を導入する方法論の開発を目的としている。前年度までに、目的部位にA→I変異を導入できるように二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼ（ADAR2）を誘導する機能性RNA「編集ガイドRNA」を、分子進化工学的手法を用いて構築できることを明らかにした。当該年度は、生体内ADAR2の基質RNAであるグルタミン酸受容体mRNA前駆体（GluRB pre-mRNA）を基に、配列設計により編集ガイドRNAを構築する方法を開発した。本設計により構築される編集ガイドRNAは、標的認識領域を有するため、任意のRNAに対して編集を誘導できると考えた。まず、GFP mRNAをモデル標的RNAとしてガイドRNAを設計し、組換えADAR2を用いたin vitro編集アッセイにより本設計が妥当であるかどうかを評価した。結果、構築した編集ガイドRNAは、目的部位に編集を誘導できることが明らかになった。続いて、編集誘導活性を示したRNA配列を基に変異体を作製し、高活性な編集ガイドRNA配列を探索した。上記研究を通して、任意のアデノシンに対して変異導入できる編集ガイドRNA設計方法を確立した。加えて、編集ガイドRNAの培養細胞内での編集誘導活性を評価するため、編集ガイドRNA発現ベクター並びに組換え細胞を樹立するための遺伝子コンストラクトを作製した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２６年度は、in vitroにおいて高い編集誘導活性を有する編集ガイドRNAの設計方法を確立した。また、編集ガイドRNAを用いた部位特異的RNA変異導入法の確立を目指し、細胞内における編集誘導活性を評価するための実験系構築も同時に行っている。平成２５年度に得られた研究成果を踏まえて、これまでに得られた研究成果は、当初の研究計画に沿ったものであり、本研究は、おおむね順調に進展していると評価できる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
平成２７年度は、編集ガイドRNAを細胞に適用し、RNA変異導入による標的タンパク質機能制御法の開発を目指す。そのため、ADAR発現細胞内における編集ガイドRNAの編集誘導活性及び、細胞内タンパク質機能・発現制御能を評価する。また、編集誘導活性が低かった場合は、細胞を基盤としたスクリーニング方法を用いて、編集ガイドRNA配列のin vivoでの最適化を行う予定である。最終的には、ADARを恒常的に発現していることが明らかな培養細胞（HepG2等）に編集ガイドRNAを導入し、内在的に発現しているADARを利用した部位特異的変異導入を評価する。本研究を通して、生体内RNA編集機構を利用した部位特異的変異導入法を確立し、生体内タンパク質機能制御法に展開する。
|
