|
本研究では、微細加工技術により作製したマイクロ流体デバイスをプラットフォームとし、電気化学的手法とDNA増幅法を組み合わせ、細菌を迅速・高感度・現場分析する手法の開発を目的としている。本年度はまず、マイクロビーズ上でのRolling Circle Amplification (RCA)法によるDNA増幅・検出の高感度化に取り組んだ。前年度に基礎検討を行い、RCA法の原理を実証した。しかし従来法では検出効率が1%程度であるため、これを向上させることで従来よりも低濃度のDNAを検出できると考えた。そこで反応系にポリエチレングリコール(PEG)を加え、分子クラウディング効果によってDNAや酵素が反応しやすい環境とし、RCA法の反応効率を向上させることとした。結果、PEGの添加に伴いRCA反応の産物数が増加した。PEGの分子量及び濃度と産物数の関係を調べ、産物数が最大となる最適濃度が存在すること、および分子量が大きいほど最適濃度が低下することを見出した。過去の研究において、分子クラウディング環境でDNAの連結・伸長反応が促進され、かつ最適濃度が存在すると報告されていることから、おそらくは本研究においても分子クラウディング効果によって産物数が増加したものと考えている。次にDNAに結合する発蛍光色素を用いたRCA産物の検出に取り組んだ。従来法ではDNAを伸長したのち、蛍光標識DNAを加えてRCA産物を検出していた。本研究ではこれを発蛍光色素に変更することで、産物により多くの色素を結合させ高感度検出が実現できると考えた。前年度はマイクロビーズへの色素の非特異吸着のために検出が困難であったため、本年度はビーズへのプライマーDNAの固定化量を変化させて実験を行ったところ、固定化量を減らすことでRCA産物に由来する蛍光輝点が観察できた。
|
