| 研究課題/領域番号 |
25790070
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 地方独立行政法人東京都立産業技術研究センター |
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研究代表者 |
月精 智子 地方独立行政法人東京都立産業技術研究センター, その他部局等, 研究員 (80520220)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | バイオセンサ / ソルビトール / 糖尿病合併症 / 光ファイバ / 蛍光検出 / 酵素サイクリング |
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| 研究概要 |
糖尿病合併症のバイオマーカーとしてソルビトールの有効性が示唆されている。本研究は、ソルビトールを選択的かつ高感度に計測できる小型なバイオセンサシステムを開発し、バイオマーカーとしてのソルビトールの有効性を検証することを目的としている。そこで今年度は、基盤技術となる「酵素サイクリング法を用いたNADH検出システムの構築」を検討した。
本研究では、高水溶性ホルマザンを生成するテトラゾリウム塩（WST）に着目し、まず、生成したホルマザンを比色定量するための光学システムの構築を行った。ハロゲン光源を光ファイバにてキュベットホルダ内の石英キュベットに導入し、光ファイバを介して小型分光器と接続し、生成したホルマザンのピーク波長460nmの透過率を計測することで、NADHの計測が可能なシステムを構築した。
次に、酵素サイクリング反応を効率的に行い、目的物質を高感度に計測するため、各試薬の濃度（WST-8、ジアホラーゼ）や緩衝液のpHにおける酵素サイクリング法の最適化を行った。その結果、WST-8、ジアホラーゼともに、1.0U/mlの濃度であれば十分量であり、また、緩衝液については、pH 8.0のリン酸緩衝液（100mM）を用いることにより、高感度かつ迅速な計測が可能であることが分かった。
また、今後、ソルビトール計測に展開する上で、先行研究で構築したNADH蛍光検出システムとの比較を行う必要があるが、計測手法が蛍光と透過率で異なるため、現状では比較が困難な状況である。引き続き、酵素サイクリング法及びNADH蛍光検出システムの光学系の改良を継続しながら、ソルビトールバイオセンサの開発に展開していく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は、①分光器や光源を用いたホルマザン測定システムの構築、②構築した測定システムによる試薬濃度や緩衝液の最適化、を実施した。今年度の研究実施計画通り、酵素サイクリング法を用いたNADH検出システムを確立したことから、本研究は順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、これまでに構築したNADH検出システムの改良を進めながら、ソルビトールバイオセンサの開発について検討する。その後、開発したソルビトールバイオセンサを用いて、糖尿病モデル動物の生体液中ソルビトール計測に展開させる予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今年度は、先行研究で使用していた光学機器や試薬等を代用して実験を遂行したため、予定していた物品費が抑えられた。また、今後の動物実験に向けて、糖尿病合併症モデルラット作製等の準備を行う予定であったが、委託業者との打合せが難航したため、外注費の執行が遅延している。
今年度構築した「酵素サイクリング法を用いたNADH検出システム」及び、先行研究で構築した「NADH蛍光検出システム」の改良を行うため、光学機器の購入を中心に計画している。また、ソルビトールバイオセンサの作製に展開するにあたり、酵素等の試薬を購入する予定である。また、今後の動物実験に向けて、委託業者との打合せを引き続き行い、モデル動物作製等の準備を行う。また、研究成果発表及び情報収集のため、国内学会への参加や論文校閲を予定している。
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