| 研究課題/領域番号 |
25810095
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
伊原 正喜 信州大学, 学術研究院農学系, 助教 (50391868)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 、[NiFe]-ヒドロゲナーゼ / 発現系 / 精製 |
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| 研究実績の概要 |
これまでに、[NiFe]-ヒドロゲナーゼの発現系の構築に成功し、ランダムライブラリの作製まで終了している。さらに、ライブラリーから活性が有意に向上した、[NiFe]-ヒドロゲナーゼ変異体の単離に成功している。これらの成果を論文にまとめて投稿したところ、レビュアーから多くの指摘を受け、共同研究者であるドイツ・ベルリン工科大レンツ教授とディスカッションを重ねたところ、[NiFe]-ヒドロゲナーゼの精製方法について看過できない問題が明らかになった。本来、[NiFe]-ヒドロゲナーゼは、細胞から抽出した後に、直ちに酸化剤にて酸化状態に変換し、クロマトグラフィー精製すべきであったが、適切に酸化することなく精製していたため、測定に用いたサンプルは大部分が失活しており、比活性値の見直しが必要となった。そこで、ドイツ・ベルリン工科大にて、レンツ教授のもとで[NiFe]-ヒドロゲナーゼ調製を学び、その新しい精製方法を日本に持ち帰り、検討したところ、[NiFe]-ヒドロゲナーゼのみならず、ギ酸デヒドロゲナーゼにおいても、活性が数倍高いサンプルが得られることがわかり、研究が大幅な進展した。現在は、[NiFe]-ヒドロゲナーゼとともにギ酸デヒドロゲナーゼの酸素失活について、各種測定可能なサンプル量（それぞれ精製蛋白質サンプルを10 mg）の確保を目指している。その後、酵素活性の再測定と、論文の再投稿、さらに酸素失活速度測定法の確立を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度報告した通り、新しい環境で培養を行ったところ、酵素活性が全く見られなくなったため、原因究明に大きな時間を割かざるを得なかった。しかし、原因はオートクレーブ後の培養液のpH値低下であることを突き止めた（pH低下の原因は不明）。そこで、オートクレーブ後、pH調節して培養したところ、酵素活性が回復した。また、上記の通り、精製方法の見直しを行うことになり、時間的なロスが生じたが、現在は精製方法が確立しており、現在、サンプルの大量調製中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、まず、サンプル大量調製を確立し、論文再投稿と、赤外吸収スペクトルや共鳴ラマンスペクトル測定を目指す。赤外吸収スペクトルや共鳴ラマンスペクトル測定については、国内外の分光学低温測定の専門家との共同研究で行い、ラピッドフリージング装置などで急速凍結したサンプルを、低温測定用セルに入れ、ミリ秒スケールでの経時変化を追跡する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画よりも備品を安価に購入できたため、次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額は、Ｈ２８年度請求額と合わせて、消耗品費として使用予定である。
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