| 研究課題/領域番号 |
25810099
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
大洞 光司 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (10631202)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | ヘムタンパク質 / 光増感剤 / 光捕集 / 超分子 |
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| 研究概要 |
本研究では、ヘムタンパク質6量体HTHPを基盤とした光増感色素の集積化および光触媒への展開を目指している。研究の初年度である本年度は、光増感剤の集積化とその光化学物性の評価を目的とした。まず、HTHPの大量発現系の構築と精製条件の最適化を実施した。イオン交換カラムとゲル濾過カラムによる精製で非常に純度の高いタンパク質溶液が得られ、電気泳動や質量分析、光散乱等の測定からホロ体の6量体ヘムタンパク質が得られていることが明らかになった。次に、酸性条件下での有機溶媒による抽出により天然ヘムの除去を行なった。最適化の結果、ヘムを99%以上除去することができた。また興味深いことにヘムを除去したアポ体においても6量体を保持している事が明らかになった。また、光増感剤として、亜鉛プロトポルフィリンおよび亜鉛クロリンe6を合成した。中性条件下でこれらの光増感剤を加えたところ、6つのヘム結合サイトに取り込まれることが、吸収スペクトルや円二色性スペクトル測定より明らかになった。また6量体を保持していることが光散乱およびサイズ排除クロマトグラフィより明らかになった。蛍光挙動について評価を行なったところ、集積化された光増感剤は天然光合成系の光捕集系の様に一重項―一重項アニヒレーションを起こしていることが示された。さらに消光剤を用いた蛍光の滴定実験では、光増感剤が一つだけHTHPに取り込まれたコントロール実験の系と比較して、より高い消光効率を示した。この結果から、色素間でのエネルギーマイグレーションが起こっていることが示され、HTHPが光捕集のための色素集積化に有用であることがわかった。上記の成果の一部は、既に関連するいくつかの学会で発表し高い評価を得ている。また学術論文として投稿予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の目的であったHTHPを基盤とした光増感剤の集積化について、予想通りの結果が得られた。種々の分光学的手法により構造の同定を行ない、6量体構造を保ったまま光増感剤である亜鉛ポルフィリンが天然のヘム結合部位に取り込まれていることが明らかになった。これは光合成細菌の光捕集系LH2のモデルとして捉えることができる。光化学物性については特に蛍光に着目して実施した。光増感剤の集積化の効果を確かめるために、一つの光増感剤がHTHPに取り込まれた系について構築し、比較、評価した。結果として、蛍光消光滴定から天然光捕集系に見られる特徴的な現象であるエネルギーマイグレーションが起こっていることが、定性的ではあるが示されている。また亜鉛クロリンを用いた系についても亜鉛ポルフィリンと同様に調製・評価した。HTHPの亜鉛クロリン置換体においても6量体構造の保持を確認し、またエネルギーマイグレーションが起こっている事が明らかになった。ヘムが抜けた状態のHTHPのアポ体も安定な6量体構造を保持しており、他の光増感剤の集積化にも利用可能な汎用的な手法となり得ることが示されており、HTHPがポルフィリノイド系光増感剤の集積化に有用であることが示された。タンパク質を基盤とした系で超分子的に光捕集系を構築した報告は少なく、HTHPタンパク質マトリクスの構造を利用することで、配向制御しながら光増感剤を集積化できることを実験的に示すことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度でHTHPの調製、ヘムの除去、光増感剤の挿入の手法を確立し、構造および光化学特性の評価を行なうことができた。今後は、他のポルフィリノイド分子の集積化および触媒能発現部位の導入により光合成モデルの構築を図る。他のポルフィリノイドとしては、亜鉛フタロシアニンや亜鉛ポルフィセンを用いる。それぞれ可視領域に強い吸収を有するので、亜鉛ポルフィリンの系よりも太陽光利用の観点から魅力的である。本年度の系と同様に光化学特性の評価を行なった後、より定量的な議論を行なうために過渡吸収スペクトルにより実際のエネルギー移動の速度を見積もる。特に構造から理論的に予想される速度と比較し、論理的に更なる効率化を見込めるかを探る。次に、触媒部位については特に亜鉛ポルフィリン等でも還元可能なコバロキシム錯体の導入を検討する。導入位置については環状集合体の中心に位置する孔部分で、そこに位置する特定の残基を変異導入法によりシステインに置換し、部位特異的な触媒部位の導入を実施する。実際にエネルギーマイグレーションが光触媒にまで影響する系は多くないので、非常に魅力的な系になると予想される。他にも更なる巨大集合体に展開し、より高い光捕集能を実現することで、天然の光合成系により近いシステムの構築をめざす。得られた成果は学会や学術論文により積極的に発表する予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
本年度では、概ね予定していた光捕集系の構築を達成したが、当初予定していた他の光増感剤への展開を全て行なうことが出来なかった。これは、タンパク質の調製・精製条件の検討に対して当初予定した期間より時間が掛かってしまったことが主な理由である。またその後のヘムの除去法の最適化、光増感剤挿入の手法に試行錯誤が必要になったため、煩雑な合成が必要になる2種の光増感剤は先送りにして、光捕集系としての評価を優先し、結果として合成試薬の経費が浮いたためである。したがって次年度には合成試薬の経費が物品費の多くを占めることになる。当初の計画より若干の遅れはあるものの、確立した調製法等は汎用性が高いので、次年度の計画の大部分はスムーズに展開出来ると予想される。
次年度は当初の計画で予定していた触媒部分の分子の合成と合わせて、光増感剤ポルフィリノイド分子の合成にも精力的に取り組むので、物品費の多くを合成試薬やガラス器具等の消耗品に使用する予定である。一方で、触媒を固定するためのシステイン残基を導入したタンパク質変異体作成のための生化学試薬、6量体構造評価のためのゲル濾過カラム、触媒活性評価や蛍光寿命測定用の特殊石英セルなどの高価な消耗品も円滑な研究の進行のために複数必要になる。また本研究の最終年度であるので国際学会での発表や学術論文誌での成果報告も予定しており、予算の一部を旅費および英文校閲費に充てる。
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