| 研究課題/領域番号 |
25810124
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| 研究機関 | 福井大学 |
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研究代表者 |
鈴木 悠 福井大学, テニュアトラック推進本部, 講師 (90600263)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 液状絹 / ＮＭＲ / 繊維化メカニズム |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、絹フィブロインの繊維化プロセスにおける凝集コントロール機構を解明することである。クモ糸タンパク質において、非繰り返し配列の末端ドメインが凝集コントロールを担っていることが近年明らかにされつつあるが、家蚕絹フィブロインではその分子量の大きさから、まだ十分な検討がなされていない。そこで本研究では、家蚕絹フィブロインＨ鎖Ｎ末端、Ｃ末端ドメイン、Ｌ鎖という非繰り返しドメインの立体構造を決定し、絹糸腺内での環境変化(pH,塩濃度)による構造変化から凝集メカニズムを明らかにすることをめざしている。
昨年度までに、非繰り返しドメインを含む繊維化前の絹フィブロイン水溶液（液状絹）の精密な立体構造解析を行った。超高分子量（約40kDa）かつ超高濃度（25%w/w)のためピークの重なりが激しく解析が困難であったが、1H, 13C, 15N高分解能ＮＭＲスペクトルと、化学シフトから二面角値を予測するプログラム（talosN)を用いることにより、特徴的な二次構造の決定に成功した。さらに、家蚕絹フィブロインの非繰り返しドメインの安定同位体ラベルタンパク質を大量生産するための、大腸菌によるタンパク質発現系の確立を進めている。入手した家蚕絹フィブロインのcDNAには、ＮおよびＣ末端ドメインの中にイントロン配列を含んでいることがわかった。そのため、イントロン配列を除去した末端ドメインのみのDNA配列の作製を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
非繰り返しドメインを含む繊維化前の絹フィブロイン水溶液（液状絹）の精密な立体構造をＮＭＲ法により決定することができた。本研究内容は、本年Macromoleculesに投稿し受理された。さらに、非繰り返しドメインの安定同位体ラベルタンパク質の大腸菌による大量発現系の構築を進めることができている。
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| 今後の研究の推進方策 |
ＮおよびＣ末端ドメインの安定同位体ラベルタンパク質の大腸菌による大量発現系の構築をさらに進める。そして、得られたタンパク質について、円二色性分光法および溶液ＮＭＲ法を用いて構造解析を行う。さらに、pHおよびイオン濃度の変化による立体構造変化を追跡し、カイコ体内での絹フィブロインタンパク質の凝集メカニズムに関する知見を得る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
補助事業期間内に所属場所が変わり、新しい研究実施場所で研究室を立ち上げることになり、研究環境のセッティングに時間を要した。そのために、研究の進行が後ろ倒しになっているため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
タンパク質の大腸菌大量発現系構築にかかわる未購入物品およびＮＭＲ測定に必要な購入物品について、研究の進捗状況を鑑みながら購入する。大腸菌によるタンパク質発現系の構築に使用する試薬の滅菌および廃棄処理に必要なオートクレーブ装置を購入予定である。繊維学会、高分子討論会、国際会議（ICMRBS 京都開催）での学会発表にかかる学会参加費・旅費を支出予定である。研究成果を国際誌に投稿する際の論文原稿の英文校閲および印刷費を支出予定である。
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