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交雑育種法では、接合型の異なる２種類の酵母（a型およびα型）を製造する必要があるが、同一の親株から派生した酵母どうしが接合する自己倍数化現象が、交雑体の製造効率を低下させる。そこで本研究では、自己倍数化を回避するための接合抑制技術を技術基盤として、接合型を変換する技術の開発を行うことで、酵母の交雑育種を促進することを目的とする。
平成26年度は、昨年度に確立した技術を改良して、産業用酵母の接合型を変換する方法を確立した。まず産業用酵母の形質転換において広く利用することが可能な選択マーカー遺伝子として、G418耐性遺伝子とハイグロマイシンB耐性遺伝子を選択した。これらの薬剤耐性選択マーカー遺伝子を、昨年度に構築した接合型変換用プラスミドに対して、栄養要求性選択マーカー遺伝子と置換して挿入することにより、産業用酵母の接合型変換に利用できる2種類のプラスミド（a型酵母取得用とα型酵母取得用）を構築した。つづいて、製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターより清酒酵母・協会7号（a/α型）を入手し、上述のように構築したプラスミドを導入して形質転換を行った。形質転換体の選別はハイグロマイシンBへの耐性を指標に行った。つづいて形質転換体を液体培地で数日間継代培養を行うことで、染色体の複製異常によってa型およびα型の酵母を出現させた。出現したa型およびα型の酵母は、G418を用いた個体培地上で単離した。得られた酵母株の接合能を評価したところ、それぞれ既知のα型もしくはa型の酵母と接合できることが確認された。以上のように、清酒酵母・協会7号（a/α型）から、交雑育種に利用することが可能なa型およびα型の接合能を有する酵母株を獲得することに成功した。
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