研究課題
本研究では、生細胞で細胞周期を可視化できる蛍光プローブ (Fucci)を導入した遺伝子改変ブタの作出を目的とした。初年度は、Fucciを発現するブタ細胞の樹立に成功し、クローン作出を行った。タイムラプス観察及びフローサイトメトリー解析により、樹立細胞がFucciの機能を有することを確認した。樹立細胞は体細胞核移植のための核ドナー細胞として、良好な増殖性と形態を維持しており、当初計画よりFucciを導入したクローンブタの作出を早く進めることができた。構築した核移植胚をレシピエントブタに胚移植し、4頭のクローン産仔を得ることに成功した。当該年度では、この得られたクローン産仔の解析および後代産仔の作出・解析を行った。クローン産仔の各組織・臓器の蛍光観察では、全身性のFucciの発現は観察されず、皮膚、心臓、骨格筋でのみ蛍光が観察され、さらにその蛍光は部分的であった。体細胞核移植に伴うエピジェネティック異常は有性生殖により解消されることが知られていることから、有性生殖により後代産仔を作出した結果、Fucciの発現はクローン産仔と同様に限定的であった。そこでクローンおよび後代産仔の線維芽細胞を樹立し、導入されたFucci遺伝子のプロモーター領域についてDNAメチル化解析を行ったところ、Fucciを発現する核ドナー細胞に比べ、DNAが高度にメチル化されていることが明らかになった。また、これら細胞をDNA脱メチル化酵素阻害剤存在下で培養した結果、Fucciの発現が確認され、DNAメチル化も解消することが確認された。本研究ではFucciとしての機能を有したブタ細胞の作出に成功し、Fucci遺伝子を導入した個体の作出できた。しかしながら、遺伝子サイレンシングにより全身にFucciを発現する個体は得られず、体細胞核移植に伴う導入遺伝子のサイレンシングは有性生殖を介しても解消されない可能性が示唆された。
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