| 研究課題/領域番号 |
25830071
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
加藤 いづみ 北海道大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (40634994)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 癌 |
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| 研究概要 |
膵癌第一選択薬ゲムシタビンの細胞死誘導効果は細胞内活性酸素濃度上昇に伴い増加する。これまでに我々はDJ-1が酸化ストレス条件下でp53のDNA結合を阻害して細胞死を抑制することを見出している。実際にDJ-1が高発現している膵癌患者は生存率が半減する。そこで本研究では膵癌第一選択薬の抗がん剤であるゲムシタビンが酸化ストレスとして働きDJ-1による細胞死抑制効果を増強する結果、ゲムシタビンに耐性を示す癌が現れると予測し、膵癌のゲムシタビン耐性機構をDJ-1によるp53抑制効果に着目して研究を進めている。
本年度、我々は膵癌細胞4種類がゲムシタビンに対する感受性が異なることを見出した。その感受性はゲムシタビン濃度10-8Mで細胞死を起こすものからゲムシタビン濃度10-4Mに対しても細胞死を起こさないものまでバリデーションがあり、本研究を進める上で必要な細胞条件を確立することが出来た。さらにゲムシタビン添加後のDJ-1量を各細胞で比較するとゲムシタビン感受性が高い細胞ほど、DJ-1発現量が低下することが明らかになった。なお、ゲムシタビン添加によるp53量には変化がなかった。また、酸化修飾、アセチル化修飾の変化を調べた。ゲムシタビン添加による細胞死の増加は、DJ-1過剰発現により解除され、細胞死の割合が低下した。DJ-1の発現量が癌の悪性度と相関すること、ゲムシタビンの細胞死誘導効果が細胞内活性酸素（ROS）濃度上昇に伴い増加することからゲムシタビン添加後の細胞内DJ-1量の変化がゲムシタビン添加後の細胞死数に関係することが予想された。また、DJ-1-p53結合部位を決定するためにp53部位欠損変異体を作成し、DJ-1との結合実験を行った結果、いくつかのp53部位欠損変異体がDJ-1と結合した。この結果から、DJ-1とp53の結合部位は少なくとも2箇所以上あることが考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成25年度の研究計画目標のひとつはゲムシタビン耐性強度の異なる膵癌細胞間でのDJ-1とp53発現量と修飾状態の比較であった。計画通りゲムシタビン感受性の異なる膵癌細胞を用いたアッセイ条件を確立してDJ-1、p53量と修飾変化を明らかにすることが出来た。また、DJ-1過剰発現がゲムシタビン添加後の細胞死の抑制に働いたことから、予想通り、DJ-1発現量とゲムシタビン耐性機構に関連があることが示唆された。DJ-1-p53結合を阻害するドミナントネガティブの設計において、研究計画では結合面を1カ所と想定していたが結合面が2カ所以上あることが明らかとなり、欠損変異体を用いたプルダウンアッセイから結合形式を直接明らかにする方法へと計画とは異なる方法へシフトした。研究の進め方は一部計画とは異なるが、研究の目的そのものは徐々に達成されつつあるので、全体評価としては概ね順調であるとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成２６年度の研究計画の目標としては、DJ-1のp53抑制による細胞死抑制機構がゲムシタビン耐性膵癌細胞において存在するのかを解明すること、DJ-1-p53結合のかい離がゲムシタビン投与後の膵癌細胞死を増加させるのか解明することを挙げている。我々の研究から、DJ-1はp53のDNA結合能をp53のDNA結合親和性依存的に阻害することでp53によるストレス後の細胞死誘導を抑制することをChIPアッセイやレポーターアッセイの実験から示している。ゲムシタビン耐性とDJ-1発現に相関があったことから膵癌細胞におけるゲムシタビン耐性下でも同様の抑制が起こっていることが予測される。２６年度はすでに確立済みであるChIPアッセイやレポーターアッセイを用いてDJ-1のp53転写阻害による細胞死抑制機構を明らかにする。さらに、引き続きドミナントネガティブを作成し、作成したドミナントネガティブを用いてDJ-1のp53転写阻害やDNA結合阻害、細胞死数の増加が起こるか検討する。最終的にはこれらの阻害条件下で変化するp53転写ターゲット遺伝子を網羅的に解析する。これにより、膵癌細胞のゲムシタビン耐性に関与する新規ターゲット遺伝子が同定できるものと期待される。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
２５年度の残額が生じた理由には、研究に使用する細胞条件が予定に比べ、早期に確立できたこと、また、ドミナントネガティブ設計の系をプルダウンアッセイから結合形式を明らかにする方法へと変更したことが大きい。それらに加え、全体的にプラスチック器具などの消耗品の節約に努めたことも理由に挙げられる。
２６年度はChIPアッセイやレポーターアッセイにおいてsiRNAを用いたノックダウン実験を多用する。そのため、２５年度の残額分はsiRNA実験とその後のレポーターアッセイの基質代、ChIPアッセイでの抗体やキット代などの消耗品に使用する。
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