研究課題
本研究ではNLRR1を標的とした新規治療法のより効率的な開発につなげていくべく、NLRR1の受容体シグナル制御メカニズムの詳細を明らかにすることを目的としている。NLRR1はEGFやIGFなど細胞増殖を促進する成長因子によるシグナル伝達を正に制御し、がんの増悪化に寄与するが、他の増殖因子シグナルの制御については不明な点が多い。そこで本年度では、特に神経芽腫において発がんと悪性化に寄与することが知られており、治療標的として重要な受容体であるALK (Anaplastic lymphoma kinase)の機能に対するNLRR1の影響について検討を行った。ALK遺伝子に変異または増幅がある神経芽腫由来細胞にNLRR1を発現させ、ALKおよび下流のシグナル分子のリン酸化について解析したところ、NLRR1の発現はALKおよびその下流シグナル分子のリン酸化を減少させ，細胞増殖を抑制することが明らかとなった。さらに免疫沈降法等による検討の結果、NLRR1はALKと細胞外ドメインを介して直接的な相互作用をもつことが明らかとなった。そこで、生体内でのALKに対するNLRR1の影響を明らかとするために、NLRR1遺伝子欠損マウスの後根神経節におけるALKの発現を免疫染色により観察したところ、野生型マウスに比べ著しい発現上昇が観察された。以上の結果から、NLRR1が受容体シグナルのうち特にALKを負に制御するメカニズムが明らかとなった。以前の研究において、NLRR1およびALKはいずれも神経芽腫の重要ながん遺伝子である MYCNにより転写制御を受けることが明らかとなっているが、タンパク質レベルでは両者に抑制的な機能制御があることが示唆される。
2: おおむね順調に進展している
NLRR1の機能を制御するメカニズムの解析のうち、これまで細胞増殖を正に制御するメカニズムの解析は順調に進んできていたが、負に制御する受容体に対する影響については不明のままであった。本年度は特にALKがNLRR1により抑制的に制御されることを見出し、そのメカニズムの一部を明らかにした。特に、正に制御する受容体とは異なり、NLRR1とALKが直接的に相互作用するという新たな知見が得られた。一方で、正の制御が脂質ラフトにおける空間的制御メカニズムによるものであることが分かってきているが、直接的相互作用のあるALKの制御において脂質ラフトが果たす役割については今後の課題である。NLRR1とALKの関係性については、NLRR1遺伝子欠損マウスを用いたin vivoにおける解析によっても裏付けられた。さらに解析を進めることにより、in vivoにおけるNLRR1の機能を制御するメカニズムを明らかに出来ると考えられる。
今後は、直接的な相互作用が明らかとなったALKのシグナルを制御するメカニズムについてさらに解析を進めていく。NLRR1の細胞増殖促進効果を抑制するNLRR1モノクローナル抗体を取得していることから、NLRR1機能の抑制がALKの活性化に与える影響を検討する。またNLRR1とALKの翻訳後修飾や脂質ラフトの影響を検討するために、糖鎖修飾の阻害およびラフトの阻害実験を行い、それらがNLRR1とALKの機能的相互作用に与える影響を検討する。一方、神経芽腫症例におけるNLRR1とALKの機能的相互作用については不明のままである。これまでの検討から、mRNAレベルでの発現に関しては、症例サンプルにおいてもin vitroにおける実験においてもNLRR1とALKの発現には相関性が認められなかったことから、タンパク質レベルでの検討が必要である。そこで、神経芽腫組織におけるNLRR1とALKの発現について、免疫組織化学的検索により検討を行う。
遺伝子改変マウスの交配・維持を引き続き行わなければならないことから、その経費を次年度に使用する必要が生じたため。
遺伝子改変マウスの飼育・維持にかかる費用に使用し、引き続きコンパウンドKO マウスの作出を行う。
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すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (5件) 産業財産権 (1件) (うち外国 1件)
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