| 研究課題/領域番号 |
25830133
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
板東 哲哉 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (60423422)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 再生 / エピジェネティクス / 脱分化 / ヒストンH3K27me3 / ポリコーム |
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| 研究概要 |
哺乳類や鳥類の器官再生能は低く、手足を失うと二度と再生することはない。これに対してコオロギなど不完全変態昆虫は高い再生能を有する。フタホシコオロギの脚を切断すると、切断面が傷上皮で覆われ、傷上皮下に再生芽が形成される。再生芽細胞は分化した細胞が脱分化した細胞と考えられており、増殖能が高く多分化能を有し、失われた器官を再生する細胞のソースとなる。再生芽細胞はパターン形成遺伝子の働きにより分化細胞へと再分化し、器官再生に寄与する。脱分化過程や再分化過程における遺伝子発現の変化はエピジェネティックな調節を受けると考えられている。再生過程に働くエピジェネティック因子を網羅的に単離するため、再生脚の形態変化を指標としたRNA干渉法(RNAi)による機能的なスクリーニングを行い、ヒストンH3K27メチル基転移酵素Enhancer of zeste (E(z))とヒストンH3K27脱メチル化酵素Utxが再分化に必要であることを見いだした。
トリメチル化ヒストンH3K27(ヒストンH3K27me3)レベルはE(z)(RNAi)個体では著しく減少し、Utx(RNAi)個体では上昇していた。いずれのRNAi個体も再生脚の形態異常が見られた。再分化過程に働く遺伝子を単離する目的で脚再生過程のRNA-Seqを行ったところ、脚パターン形成遺伝子などの配列情報が得られた。RNAi個体の再生脚における脚パターン形成遺伝子群の発現変化を調べている。
また、フタホシコオロギと近縁なタンボコオロギを使って脚再生過程を観察した。E(z)(RNAi)を行ったタンボコオロギの再生脚の形態変化はフタホシコオロギで見られた変化と同様であり、ヒストンH3K27me3を介した脚再生過程における遺伝子発現のエピジェネティックな変化は進化的に保存されたメカニズムと示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ゲノム編集技術に関して、申請時にはZinc Finger NucleaseやTALE Nucleaseが使用されていたが、現在ではCRISPR/Cas9システムが普及しつつある。本研究で実施予定のゲノム編集実験でもTALENではなくCRISPR/Cas9システムの利用を検討しており、実験に遅れが出ている。
ChIP-Seqを行う目的で、ヒストンH3K27me3を認識する抗体を用いた免疫染色を行っている。ポリクローナル抗体を用いたヒストンH3K27me3の可視化には成功しているが、ChIPグレードのモノクローナル抗体を使用すると交叉反応が見られないため、さらなる条件検討を進める。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒストンH3K27me3を認識するChIPグレード抗体の反応条件の検討をさらに進め、ChIP-SEQを行いたい。予備実験として、E(z)(RNAi)個体やUtx(RNAi)個体の再生脚での脚パターン形成遺伝子の発現変化を調べており、RNAi個体においていくつかの遺伝子の発現が変動することを明らかにしている。前年度に行ったRNA-Seqの結果を元にゲノム構造を明らかにし、ヒストンの修飾が脚パターン形成遺伝子の近傍で起こっているかを解析することで、ヒストンH3K27me3レベルの変化と脚パターン形成遺伝子の発現の変化の関連を明らかにしたい。
CRISPR/Cas9システムのコオロギへの応用は、まずは変化が可視化可能な遺伝子についてゲノム編集を行い、続いて外来遺伝子のノックイン実験を進める予定である。従来型のMonomeric CRISPR-Cas9 nucleasesの使用を考えていたが、最近、Dimeric CRISPR-Cas9 nucleasesが開発され、ゲノム編集の際のオフターゲットをより少なくできるようになった。コオロギはゲノムサイズが大きいため、新しいCRISPR/Cas9システムを用いて実験を進めていきたい。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
ChIP-Seqの実験が予定通りに進まず繰越金が生じた。
平成26年度は、抗ヒストンH3K27me3抗体を用いたChIP-SEQを行う。平成25年度の未使用額は、次年度にChIPグレード抗体を用いた抗体反応の条件検討実験に使用したい。
またゲノム編集技術を応用した外来遺伝子の導入については、最近開発されたDimeric CRISPR-Cas9 nucleasesを用いて実験を進めたい。
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