| 研究課題/領域番号 |
25840008
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
平野 泰弘 大阪大学, 生命機能研究科, 助教 (10508641)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | ラミンB受容体 / 核膜 / 転写制御 |
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| 研究実績の概要 |
細胞は数万の遺伝子の中から細胞周期や分化過程に応じて必要な遺伝子のみを正確に取り出し、厳密にその転写を制御している。このような厳密な転写制御には核内構造体が関与する。本研究では核膜内膜特異的タンパク質であるラミンB受容体（LBR）に着目し、LBRの転写制御メカニズムの解明を通して、核膜による転写制御のメカニズムを明らかにすることを目的としている。
昨年度は、一昨年度より行っているChIP-seqによるLBRの染色体結合部位の網羅的同定の精査を重点的に行った。その結果、一昨年度にHeLa細胞から得られていたChIP-seqの結果は、免疫沈降効率が低くいことに起因するバックグランドノイズの高いデータであったことが判明した。免疫沈降条件を改善して再測定したところ、LBRは巨視的には細胞の分化状態に寄らず決まった染色体結合パターンを示すことがわかった。また、LBRの染色体結合部位は、LBRの結合タンパク質であるラミンBの染色体結合部位とほぼ一致したが、LBRのみしか結合していない、「LBR特異的染色体結合部位」が存在した。LBR特異的染色体結合部位に存在する遺伝子はLBRによって直接転写制御を受けていることが予想されるため、一昨年度に得られたマイクロアレイの結果の中から、LBR特異的染色体結合部位に存在し、LBRのノックダウンによって遺伝子発現が変化する候補遺伝子についてその転写機構を検討している。
一方、特定の遺伝子座を可視化するため、ゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9を利用した染色体部位特異的なイメージングシステムの導入も行った。これによりHeLa細胞のテロメアを生細胞で観察することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度は（１）LBRによって直接転写制御される遺伝子の転写機構の解析、（２）特定の遺伝子座の転写を可視化できるイメージングシステムの構築を行う予定であった。
（１）についてはChIP-seqのデータを得るまでの条件検討に時間がかかり、当初の予定よりも遅れている。しかしながら、LBRの染色体結合部位のデータは本研究の骨格をなすものであるため、引き続き精査をしていく。
（２）に関しては、当初ZEN法を用いる予定であったが、より導入しやすいCRISPR/Cas9法に変更したことで、イメージングツールの開発は予定よりも早く行えた。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度はLBRによる直接的な転写制御の可能性が示唆された候補遺伝子について、分化依存性や転写制御メカニズムの解析を進める。当初は分化中に大規模な染色体配置の変換が起こることも予想していたため、詳細な転写制御メカニズムもChIP-seqによって解析を行う予定であったが、これまでの研究で局所における転写状態の変動が主として起こることが示唆されたため、qPCRによる定量解析に切り替えることで研究全体のスピードアップを図る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度行う予定であった解析を本年度も引き続き行うため、分子生物学試薬の購入が必要となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
qPCR用試薬など分子生物学試薬を購入する予定である。
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