| 研究課題/領域番号 |
25840010
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
中川 武弥 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (50363502)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | piRNA / 試験管内遺伝子転写 |
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| 研究概要 |
本年度は試験管内転写法によるpiRNA転写合成システムの確立を行った。piRNAクラスターを含む大腸菌人工染色体（ＢＡＣ ＤＮＡ）を鋳型とし、HeLa細胞の核抽出液を用いた試験管内遺伝子転写法によるpiRNAの合成を可能とした。この方法により得られたpiRNAの転写開始点を決定するための解析を進めており、候補となる範囲の絞り込みが進んでいる。また、試験管内転写で合成したpiRNAを他のＲＮＡから分離しより純度の高いpiRNAを得るために、試験管内転写したpiＲＮＡをBrdUでラベルし、このラベル特異的に精製する方法の確立を進めている。この方法で得られた全長のpiRNA前駆体を用いて試験管内で成熟型piRNAを合成する実験系の確立を目指し、必要な因子の同定を行い、piRNA合成の全体像の解明を行っていく。
今年度はこの研究課題で工夫を重ねている試験管内遺伝子転写法を用いて、ヒストンＨ２Ａのユビキチン化による遺伝子転写制御機構の解析も行た。脱ユビキチン化酵素であるＵＳＰ２１の二種類のサブタイプが共にヒストンＨ２Ａの１１９番目のリシンの脱ユビキチン化を行い遺伝子転写を活性化することを確認した。このように試験管内遺伝子転写法ではヒストン修飾の転写への影響を確認することが可能であり、ヒストン修飾のpiRNA転写における影響の解析も今後進めていく。ヒストンのリン酸化、メチル化、アセチル化酵素等の影響を確認する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
piRNA前駆体から成熟型piRNAの合成を行う事が出来なかった。理由は前駆体piRNAの精製方法の検討に時間を要したためである。
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| 今後の研究の推進方策 |
前駆体piRNAの精製方法の確立を至急進める。その後試験管内での成熟型piRNA合成を目指し必要な因子の同定を行う。成熟型piRNAの合成に成功すればそれを全ゲノムＤＮＡを用いた試験管内遺伝子転写に用いて、標的となる遺伝子を次世代型シーケンサを用いて同定する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
使い切れない端数が生じただけで特別な理由は存在しない。
使用計画に変更はない。
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