変性中間体を標的とした構造生物学の新展開

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25840025
• 研究種目: 若手研究(B)
• 研究機関: 立命館大学
• 研究代表者: 北原 亮 立命館大学, 薬学部, 准教授 (70512284)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: TDP-43 / RRM / OspA / pressure / NMR

研究概要

本課題では、筋萎縮性側索硬化症ASLに関わるTDP-43蛋白質及びライム病関わるOspA蛋白質について、それらの変性中間体の構造と物性解明を目的としている。これまでの高圧力NMR法を用いた構造揺らぎ研究から、TDP-43の異常凝集に強く関わるRNA結合ドメイン(RMM1)について、一部の領域の構造が壊れミスフォールドした状態が観測され、二量体及びオリゴマー、アグリゲーション形成過程のトリガーとなると考えられる(Shodai et al. JBC 2013)。またOspAについては、250アミノ酸残基中、中央からC末端側の約150残基が変性状態に転移した変性中間体の存在を確認しており、感染に際しホストとなるダニの腸管に存在するレセプター認識に役に立つコンフォメーションと考えている(Kitahara et al. Biophysical J. 2012)。
本年度、RRM1について原子間力顕微鏡(AFM)を用いた凝集体の解析を行った。AFM解析により、圧力処理及び温度処理による時間経過とともに顆粒状の凝集物が観測された。画像に基づく高さ解析により、一定の高さをもつ凝集物が観測された。また針状の線維状凝集物も観測された。同時に行ったSDSページ解析から、凝集物は単量体及び、SS結合による二量体を主として形成されていることがわかった。RRM1のミスフォールドから生じる凝集体形成過程が徐々に解明されつつある。また天然物や化合物による凝集阻害効果を検証するため、TDP-43全長の遺伝子を作成し、発現及び精製手法を確立した。
またOspAについては、25kDaという分子量の問題があり、多重標識した蛋白質試料が必要となる。無細胞システムを用いて、15N, 13C, 2Hを標識した試料作成を行った。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

RRM1は、圧力や温度など外部摂動により、ミスフォールド状態からSS結合を介した２量体を形成する。本年度、構造解析を目的として２量体を分離精製するところまで到達する予定であったが、同時並行して行っている凝集阻害評価系の構築や全長TDP-43の発現システムの構築に時間を費やした。
OspAについては、無細胞システムによる多重標識試料の発現量が低く、NMR測定に必要な十分量が得られなかった。重水を用いた発現法など他の手法を試みる必要がある。

今後の研究の推進方策

TDP-43の凝集阻害から、最終目的のALSの進行阻害効果のある化合物の発見に結びつける必要がある。RRM1のみならず全長TDP-43での評価も必要となるため、RNA相互作用や凝集に関わる評価系の構築を行う。また共同研究等により立体構造情報を用いたインシリコスクリーニングも行う。

次年度の研究費の使用計画

13C, 15N, 2Hの安定同位体標識に多くの予算を割く必要が生じた。一方で予備のセラミクス製耐圧NMRセルを約170万円で購入を予定していたが購入を見送った。既に所有しているため研究遂行に問題は生じていない。それらの差額として未使用額が発生した。
13C, 15N, 2Hの安定同位体標識試料を十分量作成するために、2-3リットルレベルの重水素、13Cグルコースなど安定同位体標識試薬の購入に使用する。またNMR装置維持のために液体ヘリウムを購入する。

研究成果

• [雑誌論文] Close identity between alternatively folded state N2 of ubiqui-tin and the conformation of the protein bound to ubiqui-tin-activating enzyme (2014)
  • 著者名/発表者名: Soichiro Kitazawa, Tomoshi Kameda, Ayumi Kumo, Maho Yagi-Utsumi,Nicola J. Baxter, Koichi Kato, Mike P. Williamson, Ryo Kitahara
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 53 ページ: 447-449
  • DOI: 10.1021/bi401617n
  • 査読あり
• [雑誌論文] Solvent Environments Significantly Affect the Enzymatic Function of Escherichia coli Dihydrofolate Reductase: Comparison of Wild-type Protein and Active-site Mutant D27E (2013)
  • 著者名/発表者名: Eiji Ohmae; Yurina Miyashita; Shin-ichi Tate; Kunihiko Gekko; Soichiro Kitazawa; Ryo Kitahara; Kunihiro Kuwajima
  • 雑誌名: Biochimica et Biophysica Acta 巻: 1834 ページ: 2782-2794
  • DOI: 10.1016/bbapap.2013.09024
  • 査読あり
• [雑誌論文] 圧力摂動によりトラップされた蛋白質のミスフォールド状態 (2013)
  • 著者名/発表者名: 北原亮、北沢創一郎、漆谷真
  • 雑誌名: 生物物理 巻: 53 ページ: 321-322
• [雑誌論文] Aberrant assembly of RNA-recognition motif 1 links to pathogenic conversion of TAR DNA-binding protein-43 (TDP-43) (2013)
  • 著者名/発表者名: Akemi Shodai, Toshifumi Morimura, Akemi Ido, Tsukasa Uchida, Takashi Ayaki, Rina Takahashi, Soichiro Kitazawa, Sakura Suzuki, Mikako Shirouzu, Takanori Kigawa, Yutaka Muto, Shigeyuki Yokoyama, Ryosuke Takahashi, Ryo Kitahara, Hidefumi Ito, Noriko Fujiwara, and Makoto Urushitani
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 288 ページ: 14886-14905
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.451849
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pressure-induced chemical shifts as probes for conformational fluctuations in proteins (2013)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara, Kazumi Hata, Hua Li, Mike P. Williamson, Kazuyuki Akasaka
  • 雑誌名: Progress in NMR spectroscopy 巻: 71 ページ: 35-58
  • DOI: 10.1016/j.pnmrs.2012.12.001
  • 査読あり
• [学会発表] High-Energy conformations of Proteins as a New Target of Structural Biology (2014)
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara
  • 学会等名: The 2nd International Symposium on Dynamic Ordering of Biomolecular Systems for Creation of Integrated Functions
  • 発表場所: キャンパスプラザ京都（京都府）
  • 年月日: 20140111-20140112
• [学会発表] Ubiquitin-activating-enzyme recognition of ubiquitin occurs by conformational selection (2014)
  • 著者名/発表者名: Soichiro Kitazawa, Tomoshi Kameda, Ayumi Kumo, Maho Yagi-Utsumi, Nicola J. Baxter, Koichi Kato, Mike P. Williamson, Ryo Kitahara
  • 学会等名: The 2nd International Symposium on Dynamic Ordering of Biomolecular Systems for Creation of Integrated Functions
  • 発表場所: キャンパスプラザ京都（京都府）
  • 年月日: 20140111-20140112
• [学会発表] 高圧力NMRによる蛋白質の準安定状態の構造解析
  • 著者名/発表者名: 北原亮
  • 学会等名: 第３回岐阜構造生物学・医学・論理的創薬研究会シンポジウム
  • 発表場所: 岐阜大学医学部（岐阜県）
  • 招待講演
• [学会発表] Misfolding trrigers a pathogenic conversion of protein conformations
  • 著者名/発表者名: Soichiro Kitazawa, Ryo Kitahara, and Makoto Urushitani
  • 学会等名: 第５１回日本生物物理学会
  • 発表場所: 京都国際会館（京都府）
• [学会発表] Solution structure of the "pure" high-energy state of ubiquitin: Q41N at 2.5 kbar
  • 著者名/発表者名: Ayumi Kumo, Soichiro Kitazawa, Tomoshi Kameda, Nicola J. Baxter, Michael P. Williamson, and Ryo Kitahara
  • 学会等名: 第５１回日本生物物理学会
  • 発表場所: 京都国際会館（京都府）
• [学会発表] Pressure and mutation enhances specific biological motion: Ubiquitin
  • 著者名/発表者名: Ryo Kitahara
  • 学会等名: 第５１回日本生物物理学会
  • 発表場所: 京都国際会館（京都府）
• [図書] 「揺らぎ・ダイナミクスと生体機能」 寺嶋正秀編 (2013)
  • 著者名/発表者名: 赤坂一之、新井宗仁、飯野亮太、上岡龍一、小井川浩之、老木成稔、岡田誠治、岡村恵美子、岡本祐幸、片岡幹雄、加藤晃一、鎌形清人、川上勝、北尾彰朗、北原亮、桑島邦博、後藤祐児、櫻井一正、佐藤啓文、嶋田一夫ら
  • 総ページ数: 368
  • 出版者: 化学同人
• [備考] 立命館大学薬学部生体分子構造学研究室
  • URL: http://www.ritsumei.ac.jp/pharmacy/kitahara/kitahara_lab.html