ヘムオキシゲナーゼと弱い相互作用を示す複合体の立体構造解析

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25840026
• 研究機関: 久留米大学
• 研究代表者: 杉島 正一 久留米大学, 医学部, 准教授 (30379292)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 電子伝達 / 分子間相互作用 / X線結晶構造解析 / 酵素

研究実績の概要

ヘムオキシゲナーゼ(HO)は、分子状酸素とNADPH-シトクロムP450還元酵素(CPR)からの還元力を利用し、ヘムをα-ビリベルジン、一酸化炭素、鉄に分解する酵素である。本研究ではCPR-HO複合体もしくはCPRの各ドメインとHOの複合体の立体構造解析を行い、CPRとHOの相互作用の詳細およびCPRからHOへの電子伝達経路について明らかにすることを目的とした。

現在までに、CPR-HO複合体を変異CPR(ΔTGEE)を用いることで安定化し、低分解能ながらX線結晶構造解析に成功した。ΔTGEE-HO複合体中で電子はNADPH→FAD→FMN→ヘムと伝達されると推定しているが、FADとFMNは20Å以上離れており、FAD→FMNの直接の電子伝達は難しい位置関係にあった。実際にΔTGEEからヘム-HO複合体への電子伝達速度は野生型CPRを用いた場合の1/250程度であり、非常に遅くなっていた。
これまでの海外の研究グループ(米ウィスコンシン大 Kim博士)らの報告では、CPRはopenとclosedの二つ以上のコンフォメーションを行き来しながら電子伝達を行うことが推定されている。ΔTGEEはopenコンフォメーションが安定化された変異CPRであり、このことと我々の決定した立体構造を合わせて考えると、openコンフォメーションはHOに結合するのに都合が良く、結合すると、FMNとヘムが近接するので、CPR-HO間の分子間電子伝達に都合の良い形、closedコンフォメーションはFMNとFADが近接しているので、CPR内部の分子内電子伝達に都合の良い形と考えることができる。CPRはこの二つのコンフォメーションを行き来することで、HOなどにうまく電子伝達を行っていると推定できた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

研究の目的であるCPR-HO複合体の構造解析に成功した。ただし、低分解能であるため、アミノ酸側鎖の構造や結合水には不明瞭な点が多く、そのレベルでのCPR-HO間の相互作用に関する議論はできない。詳細を明らかにするためには、分解能の向上が必要である。

今後の研究の推進方策

1．複合体結晶の分解能向上
複合体の精製度向上、分子間パッキングの改良、新たな結晶化条件の探索などにより、分解能の向上を図る。

２．closedコンフォメーションのCPRとHOの相互作用
現在考えている電子伝達モデルでは、closedコンフォメーションのCPRとHOは必ずしも相互作用する必要はない。実際に相互作用するかどうか、表面プラズモン共鳴法や超遠心分析によって明らかにする。これについてはclosedコンフォメーションのCPRを使った活性測定や還元速度測定も予定している。

次年度使用額が生じた理由

前年度未使用額と合わせて、概ね交付決定額通りに使用している。
残額で購入可能な試薬・消耗品で、研究遂行に必要な物品がなかったため、次年度に交付予定の予算と合わせることで、有効活用することにした。

次年度使用額の使用計画

次年度使用額は交付予定額と合算した上で、試薬・消耗品の購入に当てる。

備考

平成27年度科学技術分野の文部科学大臣表彰 若手科学者賞受賞

研究成果

• [雑誌論文] Backbone assignments of the apo and Zn(II) protoporphyrin IX-bound states of the soluble form of rat heme oxygenase-1 (2015)
  • 著者名/発表者名: Harada E., Sugishima M., Harada J., Noguchi M., Fukuyama K., Sugase K.
  • 雑誌名: Biomol. NMR Assign. 巻: 9 ページ: 197-200
  • DOI: 10.1007/s12104-014-9573-z
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Distal regulation of heme binding of heme oxygenase-1 mediated by conformational fluctuations (2015)
  • 著者名/発表者名: Harada E., Sugishima M., Harada J., Fukuyama K., Sugase K.
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 54 ページ: 340-348
  • DOI: 10.1021/bi5009694
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Insights into the Proton Transfer Mechanism of a Bilin Reductase PcyA Following Neutron Crystallography (2015)
  • 著者名/発表者名: Masaki Unno, Kumiko Ishikawa-Suto, Katsuhiro Kusaka, Taro Tamada, Yoshinori Hagiwara, Masakazu Sugishima, Kei Wada, Taro Yamada, Katsuaki Tomoyori, Takaaki Hosoya, Ichiro Tanaka, Nobuo Niimura, Ryota Kuroki, Koji Inaka, Makiko Ishihara, Keiichi Fukuyama
  • 雑誌名: Journal of the American Chemical Society 巻: 137 ページ: 5452-5460
  • DOI: 10.1021/jacs.5b00645
  • 査読あり
• [雑誌論文] ヘム鉄代謝の鍵となる電子伝達複合体の構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 杉島正一
  • 雑誌名: 日本結晶学会誌 巻: 56 ページ: 393-398
  • DOI: 10.5940/jcrsj.56.393
  • 査読あり
• [学会発表] ヒト由来ペプチド C 末端アミド化酵素の結晶構造解析を目指 して (2015)
  • 著者名/発表者名: 下川千寿、城田 ( 原田 ) 沙織、Rudzka K、杉島正一、佐藤秀明、東元祐一郎、Amzel LM、野口正人
  • 学会等名: 日本化学会第 95 春季年会
  • 発表場所: 日本大学船橋キャンパス（千葉県船橋市）
  • 年月日: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [学会発表] 新規ポルホビリノーゲン誘導体のヒドロキシメチルビランシンターゼに対する阻害剤としての効果 (2015)
  • 著者名/発表者名: 佐藤秀明、塚口舞、杉島正一、増子隆博、小俣義明、和田啓、久枝良雄、野口正人、山本健
  • 学会等名: 日本化学会第 95 春季年会
  • 発表場所: 日本大学船橋キャンパス（千葉県船橋市）
  • 年月日: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [学会発表] X 線結晶構造解析によるヘム代謝酵素複合体の立体構造解明 (2014)
  • 著者名/発表者名: 杉島正一, 佐藤秀明, 東元祐一郎, 原田二朗, 平 順一, 坂本 寛, 安永卓生, 和田 啓, 福山恵一, 山本 健, 野口正人
  • 学会等名: 立体視プロジェクションシステムを使った分子科学研究講演会
  • 発表場所: 九州工業大学飯塚キャンパス（福岡県飯塚市）
  • 年月日: 2014-12-05 – 2014-12-06
• [学会発表] 中性子結晶構造解析によるフェレドキシン依存性ビリン還元酵素-基質複合体の水素化状態可視化 (2014)
  • 著者名/発表者名: 海野昌喜、須藤久美子、日下勝弘、玉田太郎、萩原義徳、杉島正一、和田啓、山田太郎、石原真樹子、福山恵一
  • 学会等名: 平成 26 年度日本結晶学会年会
  • 発表場所: 東京大学本郷キャンパス（東京都文京区）
  • 年月日: 2014-11-01 – 2014-11-03
• [学会発表] シアノバクテリア由来ビリベルジンリダクターゼの構造・機能解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 高尾春奈、平林 佳、渡邉 彩、萩原義徳、榊原陽 一、水光正仁、福山恵一、杉島正一、和田 啓
  • 学会等名: 第 87 回日本生化学会大会
  • 発表場所: 京都国際会館（京都府京都市）
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [学会発表] NADPH-シトクロムP450 還元酵素とヘム-ヘムオキシゲナーゼ複合体との相互作用および電子伝達機構 (2014)
  • 著者名/発表者名: 杉島正一、小松将大、坂本 寛、安永卓生、佐藤秀明、東元祐一郎、原田二朗、和田 啓、福山恵一、山本 健、野口正人
  • 学会等名: 第 87 回日本生化学会大会
  • 発表場所: 京都国際会館（京都府京都市）
  • 年月日: 2014-10-15 – 2014-10-18
• [学会発表] STRUCTURAL BASIS FOR THE ELECTRON TRANSFER FROM NADPH-CYTOCHROME P450 REDUCTASE TO MAMMALIAN HEME OXYGENASE-1 (2014)
  • 著者名/発表者名: Masakazu Sugishima
  • 学会等名: 8th International Conference on Heme Oxygenases, BioIron & Oxidative Stress
  • 発表場所: The Garvan Institute of Medical Research (Sydney, Australia)
  • 年月日: 2014-10-08 – 2014-10-11
  • 招待講演
• [学会発表] NADPH-シトクロムP450 還元酵素のダイナミックな構造変化とヘムオキシゲナーゼへの電子伝達反応 (2014)
  • 著者名/発表者名: 杉島正一
  • 学会等名: 第 38 回蛋白質と酵素の構造と機能に関する九州シンポジウム
  • 発表場所: レイクサイドホテル久山（福岡県糟屋郡久山町）
  • 年月日: 2014-09-11 – 2014-09-13
• [学会発表] Complex structure of NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase and heme oxygenase-1 (2014)
  • 著者名/発表者名: Masakazu Sugishima, Hideaki Sato, Yuichiro Higashimoto, Jiro Harada, Kei Wada, Keiichi Fukuyama, Masato Noguchi
  • 学会等名: 23rd congress and general assembly of the international union of crystallography
  • 発表場所: Palais des Congres de Montreal (Montreal, Quebec, Canada)
  • 年月日: 2014-08-05 – 2014-08-12
• [学会発表] Neutron Structure of Phycocyanobilin:oxidoreductase Complexed with Biliverdin (2014)
  • 著者名/発表者名: Masaki Unno, Kumiko Ishikawa-Suto, Katsuhiro Kusaka, Taro Tamada, Yoshinori Hagiwara, Masakazu Sugishima, Kei Wada, Taro Yamada, Makiko Ishihara, Keiichi Fukuyama
  • 学会等名: 23rd congress and general assembly of the international union of crystallography
  • 発表場所: Palais des Congres de Montreal (Montreal, Quebec, Canada)
  • 年月日: 2014-08-05 – 2014-08-12
• [学会発表] NADPH-シトクロムP450 還元酵素からヘムオキシゲナーゼへの電子移動に関する構造基盤 (2014)
  • 著者名/発表者名: 杉島正一、佐藤秀明、東元祐一郎、原田二朗、和 田啓、福山恵一、野口正人
  • 学会等名: 第 14 回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: ワークピア横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2014-06-25 – 2014-06-27
• [学会発表] 中性子結晶構造解析で見るフェレドキシン依存性ビリン還元酵素 PcyA 基質複合体の水素化状態 (2014)
  • 著者名/発表者名: 海野昌喜、須藤久美子、日下勝弘、玉田太郎、萩原義徳、杉島正一、和田啓、山田太郎、石原真樹子、福山恵一
  • 学会等名: 第 41 回生体分子科学討論会
  • 発表場所: 九州大学西新プラザ（福岡県福岡市）
  • 年月日: 2014-06-06 – 2014-06-07
• [学会発表] NADPH-シトクロムP450還元酵素とヘムオキシゲナーゼの複合体構造 (2014)
  • 著者名/発表者名: 杉島正一、佐藤秀明、東元祐一郎、原田二朗、坂本 寛、安永卓夫、和田 啓、福山恵一、野口正人
  • 学会等名: 第 41 回生体分子科学討論会
  • 発表場所: 九州大学西新プラザ（福岡県福岡市）
  • 年月日: 2014-06-06 – 2014-06-07
• [学会発表] NADPH-シトクロムP450還元酵素からヘム- ヘムオキシゲナーゼ複合体への電子伝達に関する構造基盤 (2014)
  • 著者名/発表者名: 杉島正一、佐藤秀明、東元祐一郎、原田二朗、坂 本 寛、安永卓夫、和田 啓、福山恵一、野口正人
  • 学会等名: 平成 26 年度日本生化学会九州支部例会
  • 発表場所: 九州大学病院キャンパス（福岡県福岡市）
  • 年月日: 2014-05-17 – 2014-05-18
• [図書] 日本の結晶学（II)－その輝かしい発展－ (2014)
  • 著者名/発表者名: 杉島正一、他220名
  • 総ページ数: 485(294)
  • 出版者: 日本結晶学会
• [備考] ホームページ
  • URL: https://sites.google.com/site/msugishima76/