研究課題
クライオ電子顕微鏡を利用したヒトクローディン・抗クローディンホモ多量体認識抗体複合体の単粒子解析前年度まで進めていた、ヒトクローディン・抗クローディンホモ多量体認識抗体フラグメント（Fab、一本鎖Fv）複合体のX線結晶構造解析では、抗体フラグメントのみの結晶しか得ることが出来なかった。抗クローディン抗体フラグメントは抗体のみで著しく結晶化し易く、結晶化条件下において複合体を安定的に保てないことが原因の一つであると考えている。この為、結晶化工程を伴うX線結晶構造解析から電子顕微鏡による単粒子解析に立体構造解析手法を変更した。電子顕微鏡による単粒子解析では、比較的安定な多量体複合体を形成する、ヒトクローディン-1・Fabフラグメント複合体について、界面活性剤存在下で精製した試料を作成し、ネガティブ染色法とクライオ電子顕微鏡法による観察を実施した。さらに、しばしば電子顕微鏡観察の妨げになる試料中の界面活性剤ミセルを除去する目的として、膜蛋白質の膜貫通領域上の界面活性剤と置き換わる、約8 kDaの水溶性蛋白質サポシン（Nat. Methods, 2016 Apr;13(4):345-51）を利用した界面活性剤非存在下での精製試料を作成し、同様に観察を実施した。これまでのところ、界面活性剤存在下/非存在下のどちらの精製試料においても、２分子のクローディン-1に２分子のFabフラグメントが結合した複合体と推測されるY字状粒子を観測した。一方で、どちらの精製試料も、クライオ電子顕微鏡法用試料の作製時に凝集を生じる傾向があり、立体構造解析に充分な粒子数を得ることが出来ていないことが課題となっている。現在は、立体構造解析に利用する粒子数の改善の為、界面活性剤の種類と濃度などの試料条件を最適化中である。
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すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 2件、 謝辞記載あり 2件) 備考 (2件) 産業財産権 (1件) (うち外国 1件)
Scientific Reports
巻: 6 ページ: 1-10
10.1038/srep33632
巻: 6 ページ: 1-15
10.1038/srep30442
http://www.clst.riken.jp/ja/topics/research/161006news/
http://www.riken.jp/pr/press/2016/20160801_1/
