| 研究課題/領域番号 |
25840029
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 独立行政法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
竹下 大二郎 独立行政法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (80613265)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | タンパク質 / RNA / X線結晶構造解析 |
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| 研究概要 |
マイクロRNAは、特定のmRNAと相補的に結合し、mRNAの分解と翻訳抑制を誘導することによって、多くの遺伝子の発現制御を担っている。ポリウリジル化酵素TUT4は、RNA結合タンパク質Lin28によってプレマイクロRNAへリクルートされ、プレマイクロRNAをポリウリジル化することで分解経路に誘導し生合成を調節している。本研究では、TUT4・Lin28によるプレマイクロRNAのポリウリジル化機構を解明することを目的としている。
HISタグ付加したヒトポリウリジル化酵素のコンストラクトを作製し、大腸菌を用いて発現した。全長、および全ドメインを含むコンストラクトを作製し、大腸菌で大量発現した後、Niカラム、陰イオン交換カラム、ヘパリンカラム、ゲルろ過カラムを使って精製を行った。安定した状態で精製と濃縮が可能であり、結晶化スクリーニング実験を行った。しかしながら現在まで、結晶を得るところまで至っていない。精製後のサンプルで少量の分解物が見られ、結晶化を妨げていると考えられる。また、RNA合成活性部位を含むC末端領域を大腸菌で大量発現し、Niカラム、陰イオン交換カラム、ヘパリンカラム、ゲルろ過カラムを使って精製を行った。高純度で精製した後、結晶化スクリーニング実験を行った。しかしながら、この領域のタンパク質においても現在まで結晶を得るところまで至っていない。今後、さらにコンストラクトの検討を行い、結晶化を試みる予定である。また、RNAを加えタンパク質を安定化させ、結晶化実験に供していく予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ヒトポリウリジル化酵素について、様々なコンストラクトを作製し、精製と結晶化を試みているが、現在まで結晶を得るところまで至っていない。ポリウリジル化酵素のドメイン領域のタンパク質については、安定して高純度で精製できているにも関わらず結晶が得られないのが予想外であった。遺伝子の種を変更するなど、さらにコンストラクトの検討を行い、結晶化と立体構造の解明を目指す。
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| 今後の研究の推進方策 |
遺伝子の種の変更を含めて発現コンストラクトの再検討を行い、結晶化が可能であるタンパク質の調製を行う。また、RNAを混合してタンパク質の安定化を試み、結晶化を行う。さらに、TUT4と同様の活性を示すTUT7についても大量発現系の構築と精製、結晶化を行う。特に、TUT4とTUT7の間で、C末端のドメイン領域については相同性が高く、ポリウリジル化の反応機構も類似していると予測される。TUT4およびTUT7について、さらに発現系を構築し、結晶化と構造解析を目指す。
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