研究課題
若手研究(B)
本研究は、ミルク中の分泌性タンパク質であるカゼインをゴルジ体でリン酸化するキナーゼ分子（ゴルジ体キナーゼ）を明らかにすることを目的としている。ミルク中に含まれる主要なタンパク質であるカゼインは、リン酸化タンパク質として古くから知られてきた。乳腺細胞のゴルジ体画分を用いた古典的な研究により、カゼインは3種類の異なるキナーゼ（CK1, CK2, Golgi-Casein Kinase）によりリン酸化されることが示されたが、その分子実体は不明であった。これまでに本研究者は、Golgi-Casein Kinase分子としてFAM20Cを同定した。そこで、カゼインをリン酸化する残り2種類のゴルジ体キナーゼ(CK1, CK2)を同定し、ゴルジ体におけるカゼインのリン酸化機構の全容解明を目指している。カゼイン中のCK1とCK2配列をリン酸化するゴルジ体キナーゼとして、4つの可能性を考えている。1)FAM20Cとファミリーを形成する遺伝子群のいずれかがリン酸化する、2)FAM20Cがリン酸化する、3)細胞質キナーゼとして知られるCasein Kinase1と2がリン酸化する、4)未知のキナーゼ分子がリン酸化する。これらの可能性を考慮しつつ、真のカゼインキナーゼの同定を試みている。これまでに、FAM20Cとファミリーを形成する遺伝子群の発現ベクターへのクローニングを行い、発現ベクターを培養細胞へのトランスフェクションし、培養液から候補タンパク質の精製を完了した。今後、精製したタンパク質を酵素源としてキナーゼ活性を測定する予定である。
2: おおむね順調に進展している
カゼインをゴルジ体でリン酸化するキナーゼ分子（ゴルジ体キナーゼ）を明らかにすることを目的として、ゴルジ体キナーゼFour-jointedを用いたアミノ酸配列の相同性検索により、新規ゴルジ体キナーゼ候補として6種類の新規遺伝子を同定した。これらの候補分子は、本研究者がこれまでに生化学的機能を明らかにしたゴルジ体キナーゼFour-jointedおよびFAM20Cとファミリーを形成している。これらの候補分子は、キナーゼ活性に必須なアミノ酸配列が保存されているため、ゴルジ体キナーゼである可能性が高い。そこで、これらゴルジ体キナーゼの候補分子が、CK1あるいはCK2配列をリン酸化するかin vitroキナーゼ活性測定により調べることにした。平成25年度は、新規ゴルジ体キナーゼ候補分子の哺乳類細胞用発現ベクターへのクローニング、ベクターの培養細胞へのトランスフェクション、培養液からのタンパク質の精製、を完了した。研究計画においては、平成25年度中に、精製したタンパク質を酵素源としてキナーゼ活性の測定を行う予定であったが、本年度はキナーゼ活性を測定するまでには至らなかった。一方で、アミノ酸の相同性検索により、ゴルジ体キナーゼの新たな候補遺伝子として2種類を同定し、これらについても遺伝子クローニングおよびタンパク質の精製を完了した。以上から、全体として本研究は、おおむね順調に進展していると自己評価した。
今後も研究計画にしたがって研究を推進する。これまでに精製した候補分子にカゼインキナーゼ活性が認められなかった場合、FAM20CがCK1とCK2配列もリン酸化する可能性、細胞質キナーゼとして知られるCasein Kinase1と2がリン酸化する可能性、未知のキナーゼ分子がリン酸化する可能性、について検討していく。これらの実験により同定されたカゼインキナーゼが、内在性のカゼインのリン酸化にも機能しているか乳腺細胞の初代培養系を用いて確かめる。
研究計画においては、平成25年度に精製したタンパク質を酵素源としてキナーゼ活性の測定を行う予定であったが、本年度はキナーゼ活性を測定するまでには至らなかったため。次年度使用額は、精製したタンパク質を酵素源としたキナーゼ活性測定のために使用する。
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BMC Genet
巻: 15 ページ: 46
http://life.s.chiba-u.jp/ishikawa/
