in vivoイメージング解析による血管平滑筋の収縮機構の解明

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25840050
• 研究機関: 徳島大学
• 研究代表者: 堀川 一樹 徳島大学, 大学院ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (70420247)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: イメージング / cGMP / 血管平滑筋

研究実績の概要

血管平滑筋の収縮・弛緩は血圧調整を行う重要な現象であり、特に細胞内NO-cGMPシグナル伝達系は平滑筋細胞の弛緩に必須な機構である。本研究では血管平滑筋でのcGMP動態を可視化するための機能性指示薬の開発を行った。PKGIbが有する二つのcGMP結合ドメインをセンサーモチーフとするFRET型指示薬を、電気穿孔法ならびにレンチウイルスを用い、初代培養血管平滑筋細胞に導入する系を確立した。指示薬導入細胞へのNOドナー添加に伴うcGMP濃度上昇の可視化を試みたところ、十分なシグナル変化を得ることが出来なかった。指示薬のcGMP解離定数が4μMと低親和性であったため、細胞内でのcGMP濃度変化を検出するには指示薬の高感度化を含む改良が必要であることが示唆された。そこで、cGMP結合モチーフとしてPKGIbもしくはcGMP特異的ホスホジエステラーゼ(PDE5)を材料に、指示薬の高感度化とシグナル変化率の増強を試みたところ、PKGIbの有するcGMP結合モチーフのうち片方だけを用いる事で、解離定数0.5μM、シグナル変化率110%を示す改良型指示薬を開発し、HEK293細胞ならびに血管平滑筋細胞におけるcGMPダイナミクスを可視化する事に成功した。本指示薬をマウス血管に導入し、Dorsal skinチャンバーを介した二光子顕微鏡観察を行う系を立ち上げ、生体内でのcGMP動態の可視化を行っている。

研究成果

• [雑誌論文] Identification of Polyethylene Glycol-Resistant Macrophages on Stealth Imaging in Vitro Using Fluorescent Organosilica Nanoparticles. (2015)
  • 著者名/発表者名: Nakamura M, Hayashi K, Nakano M, Kanadani T, Miyamoto K, Kori T, and Horikawa K.
  • 雑誌名: ACS Nano 巻: 9(2) ページ: 1058-1071
  • DOI: 10.1021/nn502319r
  • 査読あり
• [雑誌論文] Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicato (2015)
  • 著者名/発表者名: Horikawa K.
  • 雑誌名: J Med Invest 巻: 62(1-2) ページ: 24-28
  • DOI: 10.2152/jmi.62.24.
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] In vivo visualization of subtle, transient and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca2+ indicator (2014)
  • 著者名/発表者名: Kanemaru K, Sekiya H, Xu M, Satoh K, Kitajima N, Yoshida K, Okubo Y, Sasaki T, Moritoh S, Hasuwa H, Mimura M, Horikawa K, Matsui K, Nagai T, Iino M, and Tanaka KF.
  • 雑誌名: Cell Rep 巻: 8(1),311 ページ: 311-318
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2014.05.056.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Genetically encoded Ca2+ indicators; expanded affinity range, color hue and compatibility with optogenetics (2014)
  • 著者名/発表者名: Nagai T, Horikawa K, Saito K, Matsuda T.
  • 雑誌名: Frontiers in Neuroscience 巻: 7 ページ: 1-5
  • DOI: 10.3389/fnmol.2014.00090
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [学会発表] 生理機能を可視化するFRETプローブの開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 堀川一樹
  • 学会等名: 第55回 日本生化学会 中国・四国支部例会
  • 発表場所: 愛媛大学（愛媛県松山市）
  • 年月日: 2014-06-06
  • 招待講演