| 研究課題/領域番号 |
25840055
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| 研究機関 | 光産業創成大学院大学 |
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研究代表者 |
平野 美奈子 光産業創成大学院大学, 光産業創成研究科, 講師 (80585167)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | イオンチャネル / 光感受性 / 生物物理学 |
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| 研究実績の概要 |
非侵襲な光による細胞機能制御を目指して、光刺激で細胞内イオン環境を調節する系を創ることを目的とする。そのため、カリウムチャネルのモデルチャネルと知られているKcsAチャネルを改変し、光刺激で開閉制御が可能なカリウムチャネルとカルシウムチャネルを創製する。本年度は以下の1-3を行った。
1. 改変のもとになるKcsAチャネルの不活性化に関する構造機能相関の解明： KcsAチャネルの刺激（プロトン）感受に重要な細胞内領域のプロトン化状態が、不活性化へ移行する速さだけでなく、イオン選択性へも影響を与えることを明らかにした。
2. 光感受性蛋白質付加によるKcsAチャネルの特性の改変： 昨年度、KcsAチャネルへの光感受性蛋白質（PAC）や光感受性ドメイン(LOV2)の付加により、KcsAチャネルとは特性の異なる変異体を得ることができた。本年度は、それらの変異体をさらに改変した結果、KcsAチャネル-LOV2キメラ変異体では、KcsAとLOV2を繋ぐリンカーの長さによって開確率が異なることを明らかにした。リンカーの長さを変えることにより、光刺激時に開確率の高い変異体を作製できる可能性が示唆された。
3. KcsAチャネルのイオン選択性の改変： KcsAチャネルのイオン選択性フィルター部位に3つの変異を導入することにより、カリウムイオンからカルシウムイオン透過性へ改変することに成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は、KcsAチャネルのカリウムイオン選択性をカルシウムイオン透過性へ改変することは成功したが、光感受能を付与することは達成することができなかったため、「やや遅れている」と評価した。しかしながら、リンカーの長さにより開確率が異なるKcsA-LOV2変異体を本年度作製することができたので、今後リンカーの長さを調節することで、光照射時に開確率が高い変異体を作製できる可能性が高い。このような光感受性をもつKcsAチャネルを創製できれば、本年度成功したイオン選択性の改変の変異を導入することにより、光駆動性カルシウムチャネルを創製できるはずである。
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| 今後の研究の推進方策 |
KcsA-LOV2変異体のリンカーの長さを検討し、光刺激時に開確率が高い変異体を創製する。多数の変異体を作り、それらの活性を測定して光感受性を示すものを見つけ出す予定である。
また、作製された光駆動型カリウムチャネルをもとに、光駆動型カルシウムチャネルを作製する。昨年度の結果をもとに、光駆動型カリウムチャネルの選択性フィルター部位への変異導入によりカルシウムイオン透過性に改変する。
最終的に、作製された光駆動型イオンチャネルを細胞に発現して、細胞内のイオン環境の変化を確かめる。細胞レベルで機能変化を起こす程度のイオン環境変化を起こす変異体を選び出す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究での光駆動性カルシウムチャネルの創製において、当初はカルシウムチャネルであるリアノジンチャネルを改変して光駆動性カルシウムチャネルを創製することを計画していたが、遺伝子工学的に扱いやすいKcsAチャネルの改変により目的が達成できそうなことがわかってきたため、その解析を行う必要が生じ、研究計画の遅れと次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
光駆動性チャネル変異体作製のための遺伝子工学試薬、生化学試薬： 40万円
成果報告のための旅費： 9万円
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