| 研究課題/領域番号 |
25840104
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
伊藤 照悟 名古屋大学, 高等研究院(農), 特任助教 (60632586)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 光周性 / 花成 / 概日時計 / 組織特異性 |
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| 研究概要 |
高等植物のモデル植物であるシロイヌナズナにおいて、概日時計機構と時計機構によって制御される光周性花成応答の分子メカニズムはこれまで精力的に解析されてきた。これまでに、花成応答の根幹となる日長の感知メカニズムは、遺伝子発現が概日時計によって制御されているCO、FTの２つの遺伝子が中心的に働き、重要な役割を果たしていることが知られている。この２つの遺伝子は様々な他の高等植物においても保存されており、経時的な発現パターンも非常によく似ている。このことから概日時計機構がCO、FT遺伝子をどのように転写制御しているのかを解析することは応用的観点からも非常に重要である。
植物の概日時計機構はすべての細胞で細胞自律的に機能していると考えられているが、CO、FT遺伝子は幼少期（栄養成長期）の葉の維管束組織にのみ特異的に強く発現している。技術的な問題から、組織特異性を考慮したこれら遺伝子の発現メカニズム解析はこれまで植物の時計研究においては行われていなかった。
本年度は組織特異的な細胞（葉肉細胞、維管束師部柔細胞、表皮細胞など）に特異的に発現する遺伝子のプロモーターをクローニングし各組織から核を精製するための形質転換植物体の作成を終えた。プロモーター領域の詳細な情報がない遺伝子については、GUS遺伝子との融合レポータを発現する植物体を作成し、内在の遺伝子の発現パターンの報告と、レポーターの活性領域のパターンが一致するかどうか解析した。
作出した形質転換植物体を用いて核精製プロセスを高速化するためにプロトコルの改良を行い、迅速に核を精製することが可能となった。これらの特異的な組織由来の核から精製したRNAを用いて次世代シーケンサーによってトランスクリプトーム解析を行った。今回は長日条件の日の出から16時間後のサンプルを使用したが、今後は長日、短日条件の様々な時間の遺伝子発現解析をしていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
25年度の実施計画に記載した①プロモーターのクローニング、②発現組織の解析、③形質転換植物体の作成については予定通り終了できた。③RNA-seq解析についても1条件のみであるがデータを得ることができた。年度末に研究機関を変更することが決定し若干の遅れが出たが、最も時間のかかる部分である形質転換植物体の作成が重量しているので今後の解析はスムーズに進むと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
RNA-seqにかけるサンプルのRNAが部分的に分解していることがわかった。この部分が発現解析の結果を大きく左右することが想像できるので一層の精製プロセスの高速化するためのプロトコルの改良を行う予定である。長日条件でのサンプルのみでなく短日条件で生育させた植物も使い、更に一日を通して様々なタイミングで核を精製し経時的な遺伝子発現の情報を取得する予定である。
26年度の研究実施計画にも記載したとおり組織特異的な細胞由来の核からDNAも精製し免疫沈降法を用いて細胞特異的なCO, FT遺伝子のクロマチン修飾状態（ヒストンのアセチル化、メチル化など）の変動も詳細に解析する予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
25年度末に、次年度から京都大学へ研究機関を変更することが決定された。その準備に伴って、研究計画が若干遅れ、当初購入を予定していた比較的高額のRNAからcDNAライブラリーを作成するキット一式の購入を延期したため未使用額が生じた。次年度にこれらキットを購入する予定である。
26年度は移動した京都大学で様々な消耗品の購入を予定しており、上記のcDNAライブラリー合成キット一式を購入する予定ですべての助成金が使用される予定である。
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