| 研究課題/領域番号 |
25850004
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
宮脇 克行 徳島大学, 農工商連携センター, 特任准教授 (80380111)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | ゲノム編集 |
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| 研究概要 |
一般に植物育種では、優良品種との交雑育種やゲノム上にランダムに変異を導入して偶然得られる突然変異体から目的の特性を示すものを探すため、新品種を同定するまでに長い年月を必要とした。その期間を短縮するためには、放射線を用いた突然変異育種法にかわる新しい方法が必要である。最近、ゲノム上の標的遺伝子の狙った部分を特異的に切断できる人工ヌクレアーゼの開発が進み、標的遺伝子の改変（変異を導入）が可能になってきている。本研究は、人工ヌクレアーゼによる正確なゲノム編集技術を利用し、栽培品種イチゴやトマトの新しい育種法への応用を図ることを目的としている。平成２５年度は、1.GFPを発現する形質転換体の作製、2.人工ヌクレアーゼの設計と植物用ベクターの作製、などを計画した。
まず、形質転換体の作製効率の高いトマト（マイクロトム）を用い、標的遺伝子（IAA9）を切断するためのTALENタイプの人工ヌクレアーゼを作製し、アグロバクテリウムを用いたリーフディスク法により導入して発現させた。その結果、IAA9のゲノム上に１～３塩基の欠損変異が導入されたカルスが得られてきている。これらの結果は、第３６回日本分子生物学会にて発表した（Transcription Activator-Like Effector Nucleases によるIAA9ノックアウトトマト作製の試み）。現在、論文化に向け、実験を繰り返し行なっているところであり、トマトの実験系はイチゴに応用できると考えられる。しかし、イチゴにおいてゲノム編集技術の有効性を検討するには、リーフディスク法により得られる形質転換体作製の効率が低いことが課題であった。しかしカナマイシンによる形質転換体の選抜系をブラストサイジン選抜系に変更することにより効率が向上することがわかり、日本分子生物学会にて発表した（イチゴにおける高効率な遺伝子導入法の検討）。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
トマトにおいて、人工ヌクレアーゼの設計、発現ベクターの構築、形質転換体の薬剤選抜系、DNA変異導入の解析方法などを確立できたため、ほぼ計画通りに研究を進めることができたと考えられる。また、イチゴにおいてはリーフディスク法により得られる形質転換体作製の効率が低いという問題点を解決するための方法も検討できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
アグロバクテリウムを介したRNAi（AmRNAi）法を用いることにより、着色過程における光受容体遺伝子の機能を解析する方法を開発し、その方法にて青色光受容体の１つであるphototropin2遺伝子が着色に関与することを示し、Journal of Plant Research誌に報告することができた。この手法を用いることにより、着色を促進するなどの育種に有用な遺伝子を探索することができると考えている。人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集技術による標的DNAの改変がトマトにおいては成功しつつあるが、今後、実際に単為結実性を示すノックアウト変異体が得られるかどうかを確認する必要がある。また、トマトのゲノム編集技術の実験系をイチゴに応用し、イチゴにおいてもゲノム編集技術が可能であることを示すことができれば、イチゴにおいてもノックアウト変異体を作製することができるようになり、RNAiによって有用な変化を示した遺伝子が、実際に育種に有用な遺伝子を検討することができると考えている。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成25年度と平成26年度の２年計画であり、平成２５年度は主にゲノム編集の準備、平成２６年度はその解析を行なう予定であった。しかし、共同研究者によるアグロバクテリウムや発現ベクターなどの提供があったため、平成２５年度に購入予定であった消耗品を購入する必要がなくなったことや別の実験系を準備したことなどがあり、解析に必要な経費が平成２６年度にシフトした。
試薬・キット類などの消耗品購入費、研究成果の発表や研究打ち合わせのための旅費、論文作成のための費用などに使用する予定である
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