DNAバーコードによる日本産キジラミ類の簡易同定手法の確立

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25850035
• 研究種目: 若手研究(B)
• 研究機関: 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構
• 研究代表者: 井上 広光 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 果樹研究所カンキツ研究領域, 主任研究員 (80414663)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: DNAバーコード / 日本産キジラミ類 / 同定

研究概要

平成25年度は、これまで15年間にわたって収集・蓄積してきた日本産キジラミ類昆虫の未解析サンプルを整理・同定するとともに、奄美大島、対馬、北海道、東北地方等で調査採集を行った。その結果、25年度に新たに入手できた既知種13種を含めた計106種の既知種についてDNA解析可能なサンプルが収集済みであることを確認した。これらは、日本産キジラミ類（上科）の全ての科にわたっており、属の約94%および種の約67%を網羅している。なお、調査の過程で発見された未記載種を新種として記載した。これらのサンプルから非破壊的にDNAを抽出し、DNAバーコーディングに利用されるミトコンドリアDNAのCOI（チトクロームc酸化酵素サブユニットI）領域の約700塩基対のPCR増幅条件を既報のプライマーを中心として検討したが、多くの節足動物類で汎用されるユニバーサルプライマー（Folmer et al., 1994; Hebert et al., 2003など）では増幅成功率が最大でも38%と低かった。そこで、数種のキジラミ類のCOI領域を対象に設計されたプライマー（Kuznetsova et al., 2012）を使用して条件検討したところ、60%以上の種についてPCR増幅に成功し、57種の塩基配列を決定した。25年度に塩基配列を決定できた種に限れば、形態種とDNAバーコード情報はほぼ1対1対応しており、キジラミ類の種の識別においてDNAバーコーディングが有効であることが強く示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成25年度の最大のねらいは、研究開始時までにサンプル収集済みであった種についてミトコンドリアDNAのCOI領域の塩基配列を決定し、キジラミ類の種の識別にDNAバーコード情報が使用できるかどうかを明らかにすることであった。研究開始時の楽観的な予測では汎用性プライマーを使用して容易に目的遺伝子領域のPCR増幅と塩基配列決定ができると考えていたが、多くの昆虫類で汎用されているプロトコルをキジラミ類にそのまま適用することはできないことが分かった。そこで、新たなプライマーの探索や、酵素および温度条件などPCR増幅にかかる条件の検討と最適化に多くの時間を割く必要が生じた。そのため、当年度中に収集済みの全ての種のDNAバーコード情報を解析することはできなかった。しかしながら、キジラミ類の多くの種のDNAバーコード解析に適したプロトコルを確立し、少なくとも当年度中に塩基配列を決定できた種に限れば、種の識別においてDNAバーコーディングが有効であることを明らかにできた。そのため、全体の研究目的に照らして順調に進捗しているものと考える。

今後の研究の推進方策

今後は、前年度までに収集できていない種のサンプル収集を精力的に行うとともに、塩基配列が未決定の種については新規にプライマーを設計するなどしてDNAバーコード情報の解析を進める。なお、本研究期間中にDNA解析用の新鮮なサンプルを収集することができない種については乾燥標本からのDNA抽出を試みる計画であり、26年度はこのための条件検討にも着手する。塩基配列を決定できた種について分子系統解析を行い、形態による従前の分類体系と分子分類結果との整合性を検証し、キジラミ類における分子系統分類の妥当性・正確性を評価する。

次年度の研究費の使用計画

本研究における塩基配列の解析は外部業者に委託する計画である。しかし、研究開始時に想定していた実験手法（多くの昆虫類に汎用されているプロトコル）が本研究にそのまま適用することはできないことが分かったため、新たなプライマーの探索や、酵素および温度条件などPCR増幅にかかる条件の検討と最適化に多くの時間を割く必要が生じた。そのため、年度内にすべての塩基配列の解析を完了することができず、委託解析への充当を予定していた経費の一部が未使用となった。
実験手法上の問題は年度内に解決の目処が立ったため、前年度に予定していた外部委託による塩基配列の解析を次年度の早期に実行する。

研究成果

• [雑誌論文] Cacopsylla biwa sp. nov. (Hemiptera: Psyllidae): a new pest of loquat Eriobotrya japonica (Rosaceae) in Japan (2014)
  • 著者名/発表者名: Hiromitsu Inoue, Tomoaki Nakanishi, Takemichi Kaneda
  • 雑誌名: Applied Entomology and Zoology 巻: 49 ページ: 11-18
  • DOI: 10.1007/s13355-013-0217-z
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of simple sequence repeat markers for the Japanese population of the Asian citrus psyllid, Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) (2014)
  • 著者名/発表者名: Kenta Tomimura, Hiromitsu Inoue, Toru Iwanami
  • 雑誌名: Applied Entomology and Zoology 巻: 49 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1007/s13355-014-0245-3
  • 査読あり
• [雑誌論文] Horizontal gene acquisition of Liberibacter plant pathogens from a bacteriome-confined endosymbiont of their psyllid vector (2013)
  • 著者名/発表者名: Atsushi Nakabachi, Naruo Nikoh, Kenshiro Oshima, Hiromitsu Inoue, Moriya Ohkuma, Yuichi Hongoh, Shin-ya Miyagishima, Masahira Hattori, Takema Fukatsu
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 8(e82612) ページ: 1-5
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0082612
  • 査読あり
• [雑誌論文] Defensive bacteriome symbiont with a drastically reduced genome (2013)
  • 著者名/発表者名: Atsushi Nakabachi, Reiko Ueoka, Kenshiro Oshima, Roberta Teta, Alfonso Mangoni, Mihaela Gurgui, Neil J. Oldham, Gerhild van Echten-Deckert, Keiko Okamura, Kohei Yamamoto, Hiromitsu Inoue, Moriya Ohkuma, Yuichi Hongoh, Shin-ya Miyagishima, Masahira Hattori, Joern Piel, and Takema Fukatsu
  • 雑誌名: Current biology 巻: 23 ページ: 1478-1484
  • DOI: 10.1016/j.cub.2013.06.027
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of a distinct lineage of Cacopsylla chinensis (Hemiptera: Psyllidae) in Japan on the basis of two mitochondrial DNA sequences (2013)
  • 著者名/発表者名: Hiroshi Katoh, Hiromitsu Inoue, Fumitaka Kuchiki, Youichi Ide, Nami Uechi, Toru Iwanami
  • 雑誌名: Journal of Economic Entomology 巻: 106 ページ: 536-542
  • DOI: 10.1603/EC12209
  • 査読あり
• [学会発表] ミカンキジラミ個体群の識別に有用なマイクロサテライトマーカーの開発 (2014)
  • 著者名/発表者名: 冨村健太、井上広光、岩波徹
  • 学会等名: 日本応用動物昆虫学会第58回大会
  • 発表場所: 高知大学
  • 年月日: 20140327-20140328
• [学会発表] トロエンキジラミ（半翅目：キジラミ科）の正体
  • 著者名/発表者名: 井上広光
  • 学会等名: 日本昆虫学会第73回大会
  • 発表場所: 北海道大学
• [学会発表] 農業害虫としてのキジラミ類：特に近年侵入した害虫種、警戒すべき種
  • 著者名/発表者名: 井上広光
  • 学会等名: 日本応用動物昆虫学会第58回大会
  • 発表場所: 高知大学