| 研究課題/領域番号 |
25850066
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
澤野 頼子 東京医科歯科大学, 教養部, 准教授 (00571077)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | アブシジン酸 / 分子改変 / 立体構造解析 / 乾燥ストレス耐性 |
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| 研究概要 |
植物には、乾燥や害虫など外的ストレスに対してある程度、適応し耐える能力が備わっている。乾燥ストレスに対する耐性の獲得機構には、植物ホルモンのアブシジン酸（ABA）が関わるシグナル伝達系が主要な役割を担っていることが知られている。本研究では、ABAシグナル伝達系の制御機構の構造基盤の解明およびそれに立脚した分子改変により、耐乾燥性に優れた植物の開発の基盤を構築することを目的としている。
本年度は、ABAシグナル伝達系の主要な制御タンパク質複合体を構造生物学的手法により解析し、制御の構造基盤を解明することを目指した。解析対象は、シロイヌナズナのABA受容体PYR/PYL（5種類）、タンパク質リン酸化酵素SnRK2（3種類）、タンパク質脱リン酸化酵素PP2C（4種類）とし、各タンパク質を大腸菌発現系にて発現させ、精製を行った後、GSTタグを用いたプルダウンアッセイにより、二者複合体あるいは三者複合体を形成する組み合わせを探索した。複合体形成が確認された組み合わせについて、タンパク質複合体を調製し、結晶化実験を行った。数種の組み合わせの複合体において結晶が得られ、これらについてX線回折実験を実施したが、立体構造解析を行うのに十分な高分解能の回折データを与える結晶は得られず、さらなる結晶化条件等の最適化を進めている。また、複合体形成が確認された組み合わせの各構成タンパク質について、類似タンパク質の既知立体構造との比較から変異体を作成し、相互作用解析や酵素活性測定により、相互作用や活性制御に重要なアミノ酸残基の特定を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は、ABAシグナル伝達タンパク質の分子改変を行うために様々な組み合わせのタンパク質複合体の立体構造情報を取得することを目指し、各タンパク質の大量調製、複合体を形成する組み合わせの探索、複合体の結晶化実験、類似タンパク質の既知構造に基づく変異体作成を進めることができたが、立体構造解析には至っていないため
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| 今後の研究の推進方策 |
タンパク質複合体の立体構造解析を成功させるためには良質の結晶を得る必要があり、タンパク質の発現コンストラクトの再検討や結晶化法の検討等を行う予定である。様々な組み合わせの複合体の構造解析とその比較により、各制御タンパク質の機能の多様性を説明する構造基盤を取得し、機能向上への分子改変情報として利用することができ、最終的な目標ある、高度に乾燥ストレス耐性能を有するような改変体を得る予定である。
また、タンパク質複合体の立体構造解析が困難であった場合は、類似タンパク質の既知構造に基づいて作成した変異体解析により、相互作用や活性制御に重要な残基を同定した上で、高度に乾燥ストレス耐性能を有する改変体を作成する予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
一部の研究が計画通りに進まなかったため
研究を遂行するために必要な、主に結晶化試薬やタンパク質調製用試薬等の物品費として使用する計画である。
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