| 研究課題/領域番号 |
25850067
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
岩井 伯隆 東京工業大学, 生命理工学研究科, 助教 (80376938)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | フッ素化合物 / 芳香族代謝 / ロドコッカス属細菌 / 環境微生物 |
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| 研究実績の概要 |
これまでに研究担当者らは、天然には存在しないフッ素化合物ベンゾトリフルオリド（トリフルオロメチルベンゼン）を分解・脱フッ素化する微生物、ロドコッカス属細菌を発見した。この菌は、イソプロピルベンゼン（クメン）代謝クラスターとよく似た遺伝子群（４反応に関わる代謝遺伝子７種、検出制御遺伝子２種）を保有し、これらの遺伝子が脱フッ素化に関与していることを明らかにしてきた。つまり、天然に存在しないフッ素化合物に対して、本菌は他の類似構造の化合物代謝系を巧みに変化させて新しい代謝系として機能させている事が分かってきた。
平成２７年度には、前年度に成功させたコリネ型細菌による異種発現系を用いて、ベンゾトリフルオリド代謝反応の各反応における代謝物の同定を行った。NMRと質量分析により、初発の酵素反応（BtfA1,BtfA2,BtfA3,BtfA4）では確かにベンゾトリフルオリドの酸化物が生成していることが確認された。また二番目の酵素反応（BtfB）では、その化合物が還元されベンゼン環がジヒドロキシ化されたカテコール産物が生成していることも明らかになった。また、脱フッ素化にはその下流に存在する２反応の酵素（BtfC,BtfD）は必要なく、カテコール化合物が別の経路もしくは自発的に分解し、脱フッ素化されることが分かった。一方、次世代ゲノムシークエンスを用いる事でドラフトゲノム配列を明らかにし、ベンゾトリフルオリド代謝遺伝子クラスターがゲノム上に存在することを確認できた。この菌には、他にも複数の芳香族代謝遺伝子クラスターのホモログが存在しており、ベンゾトリフルオリド以外にも芳香族系の代謝が得意な菌であることが示唆された。また、これまでにパルスフィールド電気泳動法から明らかにしていた約 150kbp のプラスミドの配列も明らかにできた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２７度の当初の目的としていた中間代謝物を用いたベンゾトリフルオリド代謝系の追跡は異種発現系を用いる事で展開でき、これまで培養液中には検出できなかった中間代謝物の検出と構造決定がなされ、脱フッ素化のカギとなる化合物がカテコール化合物であることを突き止められた。このことは、生化学的な解析において本年度の目標を順調に達成できたと評価できる。一方、ゲノム配列が明らかとなったことで、本菌が多種の芳香族代謝遺伝子を持ち合わせた菌株であることが明らかとなり、下流でどのような酵素が関与してくるのかを明らかにするのは本菌では難しい事も示唆された。コリネ型細菌が、本菌の遺伝子の機能解析に有効であることから異種発現系を利用して代謝系を明らかにしていく事が最も効率的であると考えており、来年度もその方向性で展開していく。
また、もう一つの目標として遺伝子破壊などの遺伝子工学的手法の確立を挙げていたが、この技術は昨年度の研究過程で成功した。そこで、本年度に明らかにしたドラフトゲノム配列を解析することで約 150 kb のプラスミドの全長を明らかにした。このプラスミドの複製起点などの特定には至っていないが、新しいロドコッカス宿主-ベクター系の構築に応用できると考えている。ドラフトゲノム配列から、新しいプラスミドを見つけ出すことができ、遺伝子工学技術面でも順調な進展をあげることができた。
以上の進捗状況を総括して、平成２７年度の達成度はおおむね順調であると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
・当初作成した研究計画書の予定に沿って、ベンゾトリフルオリド以外に、さらにフッ素化した化合物などを基質に用いる事で、本研究を通じて発見したフッ素化合物の代謝系を幅広いフッ素化合物の変換技術へ展開する。特に、一昨年度から成功してきたコリネ型細菌を用いた異種発現系は、余計な代謝系を持たない分本来の分解菌（ロドコッカス属細菌）より反応が簡潔に進められる。初発の酵素反応（BtfA1,BtfA2,BtfA3,BtfA4）のみを組換えたコリネ型細菌を用いる事で様々なフッ素化合物のジヒドロキシジエン型の酸化物生成を試す。また二番目の酵素反応（BtfB）も一緒に導入した株では、カテコール産物の生成に挑戦する。これらの結果は、反応の基質認識部位として最も関与することが予想される BtfA1の基質特異性に関する情報を提供するとともに、どのようなアミノ酸側鎖の改変が今後の応用に有用であるかの知見となると考えている。一連の研究を通じて、分解菌が持つ応用力の調査とさらに進化した酵素の設計を想起させる情報を得る。
・一方、昨年度明らかにしたドラフトゲノムシークエンスの情報を利用することで、これまでに培養液の19-F NMRスペクトルから発見したアミノ基導入された新規フッ素化合物の合成経路の解明を進める。鍵反応となるアミノ基導入は、代謝過程の化合物の構造から類推すると、鍵酵素は２－オキソグルタル酸からグルタミン酸を生成する酵素やオキサロ酢酸からアスパラギン酸を生成するような、２－オキソ酸にアミノ基を転移する酵素であると思われる。このアノテーションを基にゲノム情報を網羅的に探索し、遺伝子の解明を進める
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次世代ゲノムシークエンス解析や高速液体クロマトグラフィー装置修理などで想定外の出費があり、本年度の予算を大幅に超える出費となったが前年度までの繰越により、総額では若干の繰越額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
最終年度として研究の総括と次のステージへの展開を意識して使用を計画している。具体的にはNMRや質量分析、高速液体クロマトグラフィーなどによる分析による使用と、遺伝子工学技術の開発や酵素反応などの生化学的解析をバランスよく進め、これまでの予算で展開できた成果を余すことなく総括できるようにする。
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