| 研究課題/領域番号 |
25850077
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 一関工業高等専門学校 |
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研究代表者 |
中川 裕子 一関工業高等専門学校, 講師 (70435577)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | キチン / 酵素分解 / 促進因子 / 多糖バイオマス / 組換え酵素 |
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| 研究概要 |
1) キチン結合タンパクに属するSgCBP V, キチン結合ドメインを持つプロテアーゼの組換えタンパクに関して精製法を確立した。
CBDを持つタンパクはキチンアフィニティカラムで最初の精製を行った。ワンステップでは不純物が取り除けなかったため、限外濾過カラム、もしくはイオン交換カラムを用いた精製法で2段階精製する方法を確立した。また、プロテアーゼに関してもベンザミジンカラムを用いて初めの精製を行い、イオン交換カラムで2段階精製に成功した。25年度中でSgCBP II-V全て、及びキチン結合ドメインを持つプロテアーゼの精製に成功した。
2) 組換えタンパクの大量精製を行い、相乗効果試験及び詳細な活性測定をする。SgCBP II-IVに関しては、キチンを基質とした活性をUHPLCで直接測定する実験を進めている。
3）SgCBP Vに関しては、大量精製に成功し、キチンを基質とした相乗効果試験の再現性を確認中である。また、キチンと同じ多糖質であるセルロース上でも活性があることが確認できたため、セルロースと市販のセルラーゼとの組み合わせも試している。現時点では得られた分解産物の検出方法が確立できていないため、反応系をスケールアップするか、検出系を感度の高いものにするか検討中である。
4）キチン結合ドメインを持つプロテアーゼをキチン質とタンパクの複合体であるエビ殻に作用させ、酵素分解の前処理に効果を示すことを証明した。このタンパクは自己分解作用を示すため、大量精製が困難ではあるが、精製法は確立できたので、十分な精製タンパクが得られ次第さらに実験を進める。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
組換えタンパクの精製条件が思ったより順調に決定できたため、必要なタンパクを揃えることができた。いずれのタンパクも予想通りの促進効果を示し、良い再現性が得られた。
プロテアーゼに関しては大量精製の点で苦労しているが、エビ殻に作用させると後の酵素分解に効果があることが証明できた。また、変異型酵素に関しても作成を進めているところで、精製ができているものもある。
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| 今後の研究の推進方策 |
1) 引き続き相乗効果試験と至適pHや至適温度、濃度等を解析し、各酵素のキャラクタライゼーションを行う。4種類のSgCBPの働きの違いを明確にしたい。粉砕処理により、検出が簡単なように試験に適した基質を準備し、物性を調べてから使用することにより、基質の構造も考察できる。盛んに工業的利用が行われているにもかかわらず、構造解明が遅れているα-キチンを中心に解析を進めたい。他研究室との共同研究を進める。
2) SgCBP Vのセルロース上での効果を明らかにする。
3) 変異型のCBPを作成し、機能向上に応用する。
4) それぞれの基質に合わせたカスタムメイドの酵素液を提案する。至適な割合や組み合わせは、基質によって異なることが予想される。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
年度末の学会発表の際、研究の一端を担ってくれている学生の旅費に使う予定であったが、別の財源から出すことができたため残額が生じた。
試薬、もしくはプラスチック器具等の消耗品の購入に充てる予定である。
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