2014 年度実施状況報告書

農水産物中のダイオキシン類の生物学的測定法の開発とその適用

研究課題

研究課題/領域番号	25850091
研究機関	神戸大学
研究代表者	福田伊津子神戸大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (50418943)
研究期間 (年度)	2014-02-01 – 2017-03-31
キーワード	生物学的測定法 / ダイオキシン類
研究実績の概要	ダイオキシン類の簡易測定法ELISAの改良法として、従来の材料であるラット肝臓細胞質画分に加えて、モルモット肝臓細胞質画分およびマウス肝臓細胞質画分を調製し、それぞれの2,3,7,8-四塩化ジベンゾ-p-ジオキシンを用いてダイオキシン応答性を確認した。まず、従来法である32PラベルしたDREを用いたゲルシフトアッセイにより活性化したアリール炭化水素受容体(AhR)を検出した結果、モルモット肝臓細胞質画分ではラット肝臓細胞質画分での検出限界と同等あるいはそれ以上のダイオキシン応答性が見られたのに対して、マウス肝臓細胞質画分ではほとんど応答性が見られなかった。また、モルモット、マウス、並びにラット肝臓細胞質画分中のARNT（AhRパートナータンパク質）の発現量をウェスタンブロッティング法により検出した結果、マウスおよびラット肝臓細胞質画分からは検出できたものの、モルモット肝臓細胞質画分からは検出できなかった。ゲルシフトアッセイではモルモット肝臓細胞質画分を用いて活性化AhRを検出できたことから、ウェスタンブロッティングで使用した抗体の交差性がなかった可能性が考えられる。改良SW-ELISAを構築については、使用する抗体も含めて条件の検討中である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由実質的な異動に伴い研究環境が変化したこと、また研究協力が得られなかったことが大きな原因であるが、加えて、昆虫細胞発現系の構築に使用するベクター等実験材料の選抜・入手に時間がかかったことが挙げられる。
今後の研究の推進方策	これまでの研究成果により、マウス肝臓細胞質画分は改良SW-ELISAの材料として不適であると考えられるため、生体試料としてはラット肝臓細胞質画分およびモルモット肝臓細胞質画分に限定して改良SW-ELISAの構築を進める。また、これと並行して昆虫発現系の構築を推進する。活性化したAhRの評価には、改良SW-ELISAに加えて、従来法である32PラベルしたDREを用いたゲルシフトアッセイを引き続き用いる。