肝細胞特異的な外来遺伝子のゲノム挿入系の開発とその応用

2015 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 25850226
• 研究機関: 防衛医科大学校（医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究
• 研究代表者: 中村 伸吾 防衛医科大学校(医学教育部医学科進学課程及び専門課程、動物実験施設、共同利用研究, 防衛医学研究センター, 講師 (00505323)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: 遺伝子発現制御 / 遺伝子長期発現 / 生体材料 / 肝疾患モデル

研究実績の概要

本研究では、肝臓においてのみ外来遺伝子を持続的に発現させ、且つ人為的にその制御が可能な、簡便で新しいin vivo 遺伝子操作システムの開発を目指している。具体的には、静脈を介した遺伝子導入手法（hydrodynamics-based gene delivery; HGD）による外来遺伝子の肝細胞ゲノムへの永続的挿入、それに基づく生体肝特異的な遺伝子発現の切り替え（gene switching）、生体肝細胞特異的な破壊による肝硬変の誘導（肝硬変モデル動物の作製）を検討する。そして、独自開発の生体材料を用い、この肝硬変を救済できるか検討する。
研究期間の最終年度にあたる本年度は、マウスの肝細胞ゲノムにジフテリア毒素A鎖（DTA）発現遺伝子を挿入したマウスを作製した。gene switchingによってこのマウスのDTA発現遺伝子を発現誘導したところ、肝細胞ゲノム挿入後の期間によって肝機能障害の程度に差異が生じた。それらのマウスは肝硬変には至らない程度のものが大部分であったが、線維化が確認できたものもあった。肝機能障害を呈したマウスに独自開発の生体材料にHGFを担持させた複合体を経静脈的に投与したところ、生化学検査項目における改善の傾向が確認されたものがみられた。
研究期間全体を通じた本研究の成果は、HGDで導入した遺伝子の発現期間を延長させることができたこと、そして、導入した遺伝子による遺伝子の発現切り替えシステムを稼働させることができたという点に集約される。一方、導入遺伝子の発現期間を通常のHGDの場合と比べて大幅に延長させることができたものの永続的なものには出来なかったため、今後はこの点を改良して、肝臓におけるin vivo遺伝子操作システムの利便性の向上を図りたい。

研究成果

• [雑誌論文] Direct injection of CRISPR/Cas9-related mRNA into cytoplasm of parthenogenetically activated porcine oocytes causes frequent mosaicism for indel mutations. (2015)
  • 著者名/発表者名: Masahiro Sato, Miyu Koriyama, Satoshi Watanabe, Masato Ohtsuka, Takayuki Sakurai, Emi Inada, Issei Saitoh, Shingo Nakamura, Kazuchika Miyoshi.
  • 雑誌名: International Journal of Molecular Sciences 巻: 16 ページ: 17838-17856
  • DOI: 10.3390/ijms160817838
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Generation of α-1,3-galactosyltransferase-deficient porcine embryonic fibroblasts by CRISPR/Cas9-mediated knock-in of a small mutated sequence and a targeted toxin-based selection system. (2015)
  • 著者名/発表者名: Masahiro Sato, Akiko Kagoshima, Issei Saitoh, Emi Inada, Kazuchika Miyoshi, Masato Ohtsuka, Shingo Nakamura, Takayuki Sakurai, Satoshi Watanabe.
  • 雑誌名: Reproduction in Domestic Animals 巻: 50 ページ: 872-880
  • DOI: 10.1111/rda.12565
  • 査読あり
• [雑誌論文] Improved angiogenesis and healing in crush syndrome by fibroblast growth factor-2econtaining low-molecular-weight heparin (Fragmin)/ protamine nanoparticles. (2015)
  • 著者名/発表者名: Takikawa Makoto, Nakamura Shingo, Ishihara Masayuki, Takabayashi Yuki, Fujita Masanori, Hattori Hidemi, Kushibiki Toshihiro, Ishihara Masayuki.
  • 雑誌名: Journal of Surgical Research 巻: 196 ページ: 247-257
  • DOI: 10.1016/j.jss.2015.03.022.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Enhanced healing of mitomycin C-treated healing-impaired wounds in rats with PRP-containing fragmin/protamine microparticles (PRP&F/P MPs). (2015)
  • 著者名/発表者名: Megumi Takikawa, Masayuki Ishihara, Yuki Takabayashi, Yuki Sumi, Makoto Takikawa, Ryuichi Yoshida, Shingo Nakamura, Hidemi Hattori, Satoshi Yanagibayashi, Naoto Yamamoto, Tomoharu Kiyosawa.
  • 雑誌名: Journal of Plastic Surgery and Hand Surgery 巻: 49 ページ: 268-274
  • DOI: 10.3109/2000656X.2015.1034723
  • 査読あり
• [学会発表] zygote injectionに依らない生殖細胞、胚を標的とした遺伝子導入によるCRISPR/Cas9 genome editingの可能性. (2015)
  • 著者名/発表者名: 佐藤正宏, 大塚正人, 中村伸吾, 桜井敬之, 稲田絵美, 齋藤一誠, 渡部 聡.
  • 学会等名: BMB2015（第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会）
  • 発表場所: 神戸国際会議場
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] ブタ単為発生卵細胞質へのCRISPR/Cas9系mRNAの直接顕微注入によるゲノム編集は多様な標的遺伝子変異を持つ細胞を生む. (2015)
  • 著者名/発表者名: 佐藤正宏, 郡山実優, 渡部 聡, 大塚正人, 桜井敬之, 稲田絵美, 齋藤一誠, 中村伸吾, 三好和睦.
  • 学会等名: 第108回日本繁殖生物学会大会
  • 発表場所: 宮崎大学および宮崎市民プラザ
  • 年月日: 2015-09-12 – 2015-09-15