研究課題
若手研究(B)
＜研究テーマ①: Kr-h1のターゲット遺伝子の探索と機能解析＞Kr-h1のターゲット遺伝子を探索するために，Kr-h1を強制発現したカイコ培養細胞株使ってmRNAおよびmiRNAのマイクロアレイ解析を行ったが，顕著に増減が見られるmRNA およびmiRNAは見出すことができなかった，一方，別のアプローチとして行ったChIP-seqに関しては，抗体の選定と沈降効率を検証し，ChIPに適した条件を見出し，ChIP産物のシーケンスまで完了した．＜研究テーマ②: エクダイソン初期応答遺伝子を抑制するJH誘導性因子の探索と機能解析＞mRNAおよびmiRNAのマイクロアレイを用いて，エクダイソン応答遺伝子を抑制するJH誘導性因子を探索したところ，顕著に誘導される新規遺伝子を見出すことができなかった．原因として，マイクロアレイには搭載されていない遺伝子や既存のJH誘導性遺伝子（特にKr-h1）がその機能を担っているか，または新たなタンパク質合成を介さずにエクダイソン応答遺伝子を抑制している可能性が示唆された．そこで，実験の方向性を変え，ecdysone応答性遺伝子の１つであるbroad complex（br-c）のプロモーター解析を行った．br-cの転写開始点上流5kbとルシフェラーゼを連結したコンストラクト（br-cP_Luc）を作製し，カイコ培養細胞でJHおよびエクダイソンに対する応答性を調査した．その結果，br-cのmRNA発現プロファイルと同様に，br-cP_Lucはエクダイソン依存的に活性化され，JHを添加するとエクダイソン応答性が低下することが明らかになった．
2: おおむね順調に進展している
マイクロアレイによる候補遺伝子の探索では，２つの研究テーマともに新たな候補遺伝子を見出すことができなかったが，別のアプローチで行ったChIP-seqおよびbr-cのプロモーター解析により，着実に研究成果をあげることができた．
＜研究テーマ①: Kr-h1のターゲット遺伝子の探索と機能解析＞昨年度得られたChIP-seqのシーケンスデータをゲノムにマッピングし，ピークコールの推定およびアノテーションを行い，Kr-h1の結合サイトを特定すると共に，ターゲット遺伝子の予測を行う．得られた候補遺伝子は，定量PCRを用いてChIP-seqの再現性を確認すると共に，カイコ皮膚での発育変動を定量PCRで観察し，すでに報告されているホルモンtiterや蛹化因子との関係を比較する．またcording RNAに関しては，コクヌストモドキからオーソログを探索してRNAiを行い（カイコ幼虫ではdsRNAによるRNAiの効果が低いため），遺伝子間の関係を発現レベルで解析する．non-cording RNAが見出された場合には，ノックダウンプローブを設計し，遺伝子間の関係を発現レベルで解析する．この段階までの解析結果をもとに有力な候補遺伝子を絞り込み，遺伝子ノックアウトまたは強制発現カイコを作出し，次年度の機能解析に備える．＜研究テーマ②:エクダイソン初期応答遺伝子を抑制するJH誘導性因子の探索と機能解析＞エクダイソン初期応答遺伝子を抑制するJH誘導性因子の探索と機能解析を行うために，br-cのプロモーター解析を進める．具体的には，br-cプロモーター（5kb）の削り込みを行い，JH応答配列（JHRE）を特定するとともに，RNAi法を用いてJHREに相互作用する候補因子の探索を行う．
外注したChIP-seqの結果が予定よりも遅くなったため，定量PCRによる再現性を調べることができなかった．本年度はじめにこの予算で定量PCR用試薬を購入し，ChIP-seqの再現性を確認する．
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Developmental Biology
巻: 388 ページ: 48-56
10.1016/j.ydbio.2014.01.022. Epub 2014 Feb 4
