細胞表層提示型キチナーゼのキチン分解機構の解明と糖転移活性向上によるオリゴ糖生産

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25850234
• 研究種目: 若手研究(B)
• 研究機関: 福井県立大学
• 研究代表者: 伊藤 貴文 福井県立大学, 生物資源学部, 講師 (10402827)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: Chitinase / Paenibacillus / Structural biology

研究概要

本課題研究は、Paenibacillus 属細菌由来新規なキチナーゼChiWの複合ドメイン構造による強力なキチン分解の分子機構を明らかにし、糖転移活性を向上させることによって、キチンおよびキチンオリゴ糖の利用拡大に資することを目的としている。本年度は、ChiWの「複合ドメイン構造」と「高いキチン分解活性」の構造機能相関解析に着手した。
(1) ChiW触媒反応の解析: ChiWのキチンおよびそのオリゴ糖に対する反応様式を明らかにするため、ChiW全体、触媒ドメインのみ、立体構造不明ドメインのタンパク質試料を調製した。立体構造不明ドメインのみにはキチン分解活性は認められなかったが、ChiW全体および触媒ドメインのみには分解活性が認められ、キチンはランダムに分解され、最終的には2糖にまで分解された。その反応の最適温度、最適pHは、それぞれ50℃、pH 5 付近であった。
(2) ChiWのX線結晶構造解析: ChiWがキチンを強力に分解できる立体構造的要因を明らかにするため、タンパク質試料の精製条件と結晶化条件の再検討を行った。結果、ChiW全長の結晶の回折データの分解能を2.6から2.1オングストロームにまで向上することができた。触媒ドメインのみの結晶に関しては、1.93オングストローム分解能の回折データが得られた。
(3) ChiW立体構造の動きの解析: キチンとの結合/分解の際に生じる動きを解析するため、円二色性スペクトルデータの取得を試みた。結果、ChiWの立体構造不明ドメインが主にβ-ストランドで構成されていることを明らかにした。
次年度は、立体構造不明ドメインの機能解析を進め、立体構造と強力なキチン分解能力との相関解析を行う。また、ChiWの糖転移活性の向上とキチンオリゴ糖の合成研究も進めていく。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ChiWの「複合ドメイン構造」と「高いキチン分解活性」の構造機能相関解析を進め、下記の成果を得た。
(1) ChiW触媒反応の解析: ChiW解析用試料が調製でき、その諸性質を明らかにすることができた。また、結果を論文として掲載することができた。
(2) ChiWのX線結晶構造解析: ChiW解析用試料の精製度をこれまでよりも向上させることができ、さらに回折データ質を向上することができた。また、触媒ドメインのみの結晶に関しての結果を論文として掲載することができた。
(3) ChiW立体構造の動きの解析: ChiW全長あるいは触媒ドメインのみの円二色性スペクトルデータを取得することができ、ChiWの立体構造解析技術として確立することができた。また、結果は論文として掲載することができた。
これらの成果はおおむね当初の研究計画のとおりである。

今後の研究の推進方策

課題提案書の通り、研究を進めていく。
1. ChiWの「複合ドメイン構造」と「高いキチン分解活性」の構造機能相関: 初年度に得られた回折データをもとにChiW全長構造を精密に決定する。また、機能不明ドメインと糖との結合実験を行い、その機能を明らかにする。さらに、立体構造をもとに分子動力学的シミュレーション実験を行い、強力なキチン分解能力を立体構造的に解明する。
2. ChiWの糖転移活性の向上とキチンオリゴ糖の合成: 他のキチナーゼの研究で糖転移活性に影響を与えることが知られているアミノ酸残基を他のアミノ酸に変異させた酵素ライブラリーを作製する。そして、糖転移活性が向上したものを選択する。さらに、立体構造や反応様式の解析結果に基づき、基質の親和性、および触媒残基のpKaに関わる残基について、変異体を作製し、同様にスクリーニングを行う。
3. キチンオリゴ糖の合成条件の最適化
ChiWあるいは糖転移高活性型ChiWを用いて、基質と反応条件を変化させ、オリゴ糖合成条件を最適化する。変異体と糖転移活性の相関を解析することで、活性部位と糖転移活性に関する新たな知見を得る。

次年度の研究費の使用計画

若手研究(B)が基金化可能であり、それを利用するため。今回、年度末に論文の掲載が決まり、まだ支払いが確定していないことや、さらに、年度をまたいで論文投稿準備を行っており、そのための予算を基金として確保するため、差額が生じた。
差額は論文掲載料および論文投稿費用などに利用する。

研究成果

• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray analysis of the catalytic domains of Paenibacillus sp. strain FPU-7 cell-surface-expressed chitinase ChiW. (2014)
  • 著者名/発表者名: Itoh, T., Hibi, T., Sugimoto, I., Suzuki, F., Fujii, Y., Taketo, A. and Kimoto, H.
  • 雑誌名: Acta Crystallogr. F Struct. Biol. Commun. 巻: 70 ページ: 350-353
  • DOI: 10.1107/S2053230X14002325
  • 査読あり
• [雑誌論文] Overexpression, purification, and characterization of Paenibacillus cell surface-expressed chitinase ChiW with two catalytic domains. (2014)
  • 著者名/発表者名: Itoh, T., Sugimoto, I., Hibi, T., Suzuki, F., Matsuo, K., Fujii, Y., Taketo, A. and Kimoto, H.
  • 雑誌名: Biosci. Biotechnol. Biochem. 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1080/09168451.2014.891935
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cooperative degradation of chitin by extracellular and cell surface-expressed chitinases from Paenibacillus sp. strain FPU-7. (2013)
  • 著者名/発表者名: Itoh, T., Hibi, T., Fujii, Y., Sugimoto, I., Fujiwara, A., Suzuki, F., Iwasaki, Y., Kim, J-K., Taketo, A. and Kimoto, H.
  • 雑誌名: Appl. Environ. Microbiol. 巻: 79 ページ: 7482-7490
  • DOI: 10.1128/AEM.02483-13
  • 査読あり
• [学会発表] Paenibacillus属細菌由来キチン分解酵素ChiWのN末端領域の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 伊藤 貴文, 日ビ 隆雄, 高宮 杏奈, 鈴木 史子, 杉本 郁美, 藤井 豊, 武藤 明, 木元 久
  • 学会等名: 日本農芸化学会2014年度大会
  • 発表場所: 川崎市, 明治大学
  • 年月日: 20140328-20140328
• [学会発表] Paenibacillus str. FPU-7由来キチナーゼ ChiWのN末端領域の機能解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 高宮 杏奈, 伊藤 貴文, 日ビ 隆雄, 大門 結花, 髙木 良樹, 仲上 真由, 鈴木 史子, 杉本 郁美, 藤井 豊, 武藤 明, 木元 久
  • 学会等名: 2013北陸合同バイオシンポジウム
  • 発表場所: 七尾市, 国民宿舎能登小牧台 コンベンションホール「万葉」
  • 年月日: 20131108-20131109
• [学会発表] Chitinases secreted by Paenibacillus sp. strain IK-5 form a huge complex. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kimoto, H., Itoh, T., Hibi, T., Fujiwara, A., Fujii, Y., Tanaka, Y., Suzuki, F., Taketo, A., Kusaoke, H.
  • 学会等名: 10th Asia-Pacific Chitin & Chitosan Symposium
  • 発表場所: 米子市, 米子コンベンションセンター BIG SHIP
  • 年月日: 20131004-20131008
  • 招待講演
• [備考] 応用生化学領域ホームページ
  • URL: http://biotech.fpu.ac.jp/3f.html
• [備考] 教員情報
  • URL: http://fpuinfo.fpu.ac.jp/fpu/system/php/faculties_open/showone.php?id=ito-t