| 研究課題/領域番号 |
25860052
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 静岡県立大学 |
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研究代表者 |
刀坂 泰史 静岡県立大学, 薬学部, 助教 (00583973)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 心肥大 / PRMT5 / MEP50 / GATA4 / p300 / メチルトランスフェラーゼ |
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| 研究概要 |
心疾患は我が国における死亡原因の上位であり、この問題の克服は重要である。これまでに、p300/GATA4転写経路が心肥大から心不全発症に至る遺伝子発現調節に極めて重要であることを示した。さらに申請者は新規GATA4結合分子としてアルギニンメチル化酵素PRMT5とその活性制御因子MEP50を同定し、心筋細胞においてPRMT5/MEP50複合体がp300/GATA4経路に対し、抑制的に働くことを明らかにした。しかし、その作用分子機構と生体での心肥大及び心不全発症における役割は不明である。そこで本研究では、心肥大及び心不全発症におけるPRMT5/MEP50複合体によるp300/GATA4転写経路調節機構を明らかにすることを目的とした。平成25年度の研究実施計画として、(1) p300メチル化部位の同定及び (2) 心臓特異的PRMT5発現トランスジェニック (TG) マウスでの検討とした。その結果、メチルトランフェラーゼアッセイとGST pull-downアッセイによりp300とPRMT5の結合部位およびメチル化部位の同定に成功した。現在はp300のアルギニン残基を変異させたミュータントを作成中である。またPRMT5の活性制御因子であるMEP50についても検討を行っており、p300と結合することを明らかにした。結合部位は同じ部位であったため、PRMT5/MEP50複合体としてp300に結合し、メチル化すると考えられる。さらにPRMT5過剰発現により細胞内ヒストンのアセチル化が抑制されたことからp300のヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を抑制していることが考えられた。またTGマウスについては系統を確保し、心臓特異的な過剰発現を確認した。小規模による検討は行ったもののまだ数が少ないために、現在引き続き解析中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
目的の全ては達成できていないが、おおむね達成できており、研究としてはおおむね順調に進展していると言える。研究目的 (1) については順調に進展しており、PRMT5によるp300のメチル化とその影響について明らかにできると確信している。研究目的 (2) についても順調に進展しているが、これまでに小規模サンプル数の解析しか行っておらず、一部の解析は進展または終わっているが、まだn数が少なく、さらなる検討が必要である。マウス実験に時間がかかっている理由としては共同研究先へのマウス搬入手続きの際に微生物検査に問題があったため時間がかかってしまったことがある。
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| 今後の研究の推進方策 |
順調に進展しており申請書と特に大きな変更はない。
研究目的 (1) GATA4誘導転写反応におけるp300アルギニンメチル化の機能解析
p300アルギニン点変異体を用いたメチル化の役割の解明を目的とする。PRMT5によってメチル化されるアルギニン残基を置換したp300変異体を用いて、GATA4依存的転写反応への影響を検討する。PRMT5は野生型p300によって誘導されるGATA4の転写活性を抑制する。そこで変異型p300によって誘導されるGATA4の転写活性に対するPRMT5の抑制効果についてレポーターアッセイやクロマチン免疫沈降法などで検討する。またin vitro HATアッセイにより直接p300のHAT活性に与える影響についても検討する。
研究目的 (2) 動物レベルにおけるPRMT5の心肥大・心不全発症における機能解析
大動脈結紮手術 (TAC) により圧負荷モデルを作成し、心肥大への影響を心臓/体重比、組織染色、定量PCR、WB法により調べる。さらに冠動脈結紮手術による心筋梗塞 (MI) モデルを作成し、TACモデル同様に検討を行う。TACとMI両モデルにおける心臓機能の変化を心臓超音波検査にて検討するのに加え、同様に生化学的・組織学的な解析も行う。
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