電位依存性ホスファターゼが膜電位変化に応じて基質を変える分子機構の解明

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25860163
• 研究種目: 若手研究(B)
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 坂田 宗平 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 招へい教員 (40528006)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: イノシトールリン脂質 / 膜電位 / 脱リン酸化酵素

研究概要

電位依存性ホスファターゼVSPは電位センサーと酵素ドメインから形成され、電位依存的に種々のイノシトールリン脂質を脱リン酸化する活性を持つ。最近、VSPはPI(3,4,5)P3、PI(4,5)P2, PI(3,4)P2を基質として認識し、さらに基質の選択性が膜電位に依存する可能性が報告された。VSPはPI(3,4,5)P3を脱リン酸化することでPI(3,4)P2を産生し、さらにPI(3,4)P2を脱リン酸化しPI(4)Pを産生すると考えられているが、これまでの方法ではPI(3,4)P2の産生と脱リン酸化の反応が素早く行われた場合、PI(3,4)P2の経時的な変化を詳細に計測できなかった。そのため本研究課題の初年度ではまず、より高い時間分解能でPI(3,4)P2の動態を計測するシステムを構築することを目的とした。これまでPI(3,4)P2を特異的に認識することが知られているTAPP1と呼ばれるタンパク質のPH domainに蛍光タンパク質であるGFPを結合させて、細胞膜表面のGFPの蛍光強度変化としてPI(3,4)P2の増減を計測していたが、これをYFPまたはCFPを繋げた２種類のタンパク質を細胞の中で発現させ、二つの蛍光タンパク質の間で生じるFRETを計測する方法に変えることで、より速いPI(3,4)P2の動態変化を計測することに成功した。この方法は、PI(3,4,5)P3やPI(4,5)P2といった他のイノシトールリン脂質にも応用可能であり、高い時間分解能でVSPの脱リン酸化活性を詳細に計測する系を構築することができたと言える。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の予定どおり、FRETの方法を用いてVSPの酵素活性をより速い時間分解能で計測することに成功した。しかしながら平行して行う予定であった変異体の作成が、若干遅れている。そのため、おおむね順調に進展しているとした。

今後の研究の推進方策

本研究課題は、VSPが電位依存的な基質選択性を示す分子メカニズムを明らかにすることであるが、これは酵素ドメインが電位センサーの動きに応じてどのように立体構造を変化させるのか、明らかにすることに他ならない。最近、米国のPeter Schulz博士のグループがタンパク質の任意の場所に蛍光ラベルを導入する方法を開発した。この方法を用いれば酵素ドメインの任意の場所を蛍光ラベルできるため、膜電位変化に応じてどのように酵素ドメインが構造変化するか、明らかにできると期待される。今後、この実験系を立ち上げ、酵素ドメインの様々場所を蛍光ラベルすることで、膜電位変化に応じた酵素ドメインの立体構造の変化、およびどのような立体構造の変化が基質選択性に関わってくるのか、詳細な酵素活性の計測結果と合わせて明らかにしていきたいと考えている。

次年度の研究費の使用計画

本研究課題は２か年計画として採択された。次年度は２年目に該当する。
先に記したとおり、タンパク質の任意の場所に特異的に蛍光ラベルを導入する方法を用いて、VSPの酵素ドメインに蛍光ラベルを導入する。蛍光シグナルを検出することで電位変化に応じてどのように酵素ドメインが構造変化するのか明らかにする。酵素ドメインの電位依存的な構造変化が明らかになれば、VSPの電位依存的な基質選択性の分子メカニズムが明らかになると期待される。部位特異的な蛍光ラベルおよび蛍光測定のために、人工蛍光アミノ酸、変異体作成のための試薬、蛍光計測のためのフィルタなどを購入する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Potential role of voltage-sensing phosphatases in regulation of cell structure through the production of PI(3,4)P2. (2014)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi S., Kurokawa T., Taira I., Aoki N., Sakata S., Okamura Y. & Homma KJ.
  • 雑誌名: J. Cell Physiol. 巻: 229 ページ: 422-433
  • DOI: 10.1002/jcp.24463.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Phosphatase activity of the voltage-sensing phosphatase, VSP, shows graded dependence on the extent of activation of the voltage sensor. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sakata S. & Okamura Y.
  • 雑誌名: J. Physiol. 巻: 592 ページ: 899-914
  • DOI: 10.1113/jphysiol.2013.263640
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] A Kir3.4 mutation causes Andersen-Tawil syndrome by an inhibitory effect on Kir2.1. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kokunai Y, Nakata T, Furuta M, Sakata S, Kimura H, Aiba T, Yoshinaga M, Osaki Y, Nakamori M, Itoh H, Sato T, Kubota T, Kadota K, Shindo K, Mochizuki H, Shimizu W, Horie M, Okamura Y, Ohno K, Takahashi MP.
  • 雑誌名: Neurology 巻: 82 ページ: 1058-1064
  • DOI: 10.1212/WNL.0000000000000239
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] X-ray crystal structure of voltage-gated proton channel. (2014)
  • 著者名/発表者名: Takeshita K. Sakata S., Yamashita E., Fujiwara Y., Kawanabe A., Kurokawa T., Okochi Y., Matsuda M., Narita H, Okamura Y. & Nakagawa A.
  • 雑誌名: Nat. Struct.& Mol. Biol. 巻: 21 ページ: 352-357
  • DOI: 10.1038/nsmb.2783
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Chimeric study between sea urchin and mouse orthologs of voltage-gated proton channel revealed the critical sites for the activation speed (2014)
  • 著者名/発表者名: Souhei Sakata, Nana Miyawaki, Tatsuki Kurokawa, Nurdan Oezkucur, Yasushi Okamura
  • 学会等名: 第９１回日本生理学会大会
  • 発表場所: 鹿児島大学 郡元キャンパス
  • 年月日: 20140316-20140316
• [学会発表] 電位依存性ホスファターゼ 噓倀 の酵素活性は、電位センサーの活性化レベルに 応じて段階的に発揮される (2013)
  • 著者名/発表者名: 坂田宗平、岡村康司
  • 学会等名: 第106回近畿生理学談話会
  • 発表場所: 奈良県立医科大学
  • 年月日: 20131102-20131102