| 研究課題/領域番号 |
25860175
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
榎木 亮介 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00528341)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 概日リズム / イメージング / カルシウム / 神経ネットワーク / 時計遺伝子 / 共焦点 / 蛍光タンパク質 / FRET |
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| 研究概要 |
哺乳類の中枢時計は脳視床下部の視交叉上核に存在し、約２万個の神経細胞がネットワークを形成する。視交叉上核はネットワーク内に複数の領域振動体を形成し、振動体同士が連絡する階層的な多振動体構造を有する。個々の細胞におけるリズム発振のメカニズムについては時計遺伝子発現の転写翻訳ループが想定され、特に近年詳細な分子機構の解明が急速に進んでいる。一方で、神経細胞集団での現れてくる機能やそのメカニズムについては殆ど分っていない。
本研究課題では、独自に開発した長期蛍光タイムラプスイメージングにより、神経細胞ネットワークにおける概日カルシウムリズムを“高空間分解能”に、また数百～1,000個規模の神経細胞の活動を“網羅的”に可視化解析することで、概日リズム中枢を司る神経細胞ネットワークの作動基盤を解明することを目指している。
本年度は、時計遺伝子の緑色レポーターマウスから視交叉上核切片を作成し、アデノ随伴ウイルスにより多色カルシウムプローブを発現させることで、時計遺伝子とカルシウムの同時測定を行なった。得られた画像データから、概日リズムの主要パラメーターである頂点位相・振幅・最低値・周期を解析プログラムを用いて自動計算により求め、空間マッピングを行なうことで、両者の時間および空間的差異を詳細に解析している。また時計遺伝子とカルシウムの機能連関を明らかとする為、主要な時計遺伝子を欠損する遺伝子改変動物や、シグナル分子/受容体の阻害薬・促進薬を用いて、両者の時空間パターンの変動を観察している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
3カ年計画の初年度は、本研究の中心的課題である「時計遺伝子とカルシウムの同時イメージング」を達成し、両者の時空間的な差異を観察することを可能とした。これまでに幾つかのプレリミナリなデータを得ており、①視交叉上核の吻側の背側領域においてカルシウムリズムの位相が約12時間反転する部位が存在すること、②カルシウムリズムは時計遺伝子発現に比べてリズム位相が3時間程度前進していること、③カルシウムリズムのピーク位相は動物の主観的昼の中央付近であること、④主要な時計遺伝子欠損動物ではカルシウムリズムが消失すること、などを観察している。今後も計画通りに着実に実験を進めることで、細胞ネットワークとしての機能を明らかに出来ると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
時計遺伝子とカルシウムの時空間パターンの差異をさらに詳細に観察し、今後も細胞ネットワークとしての機能を解析してゆく。またCre-LoxPシステムを用いることで、神経細胞集団の細胞種特異的可視化を可能とする。既にこれまでに視交叉上核の主要な神経ペプチドであるAVPおよびVIPのCre発現マウスを入手しており、視交叉上核切片にアデノ随伴ウイルスを感染発現させることで、AVPやVIP陽性細胞に特異的なカルシウムイメージングを可能とする。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成25年度では、21,409円の未使用額が発生した。これは平成25年度末に購入した物品の支払が平成26年4月に支払われることになったため、生じたものである。
平成26年5月現在では未使用額はない。
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