| 研究課題/領域番号 |
25860175
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
榎木 亮介 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00528341)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 概日リズム / カルシウム / イメージング / 時計遺伝子 / 生物時計 / 視交叉上核 / 蛍光プローブ / 共焦点 |
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| 研究実績の概要 |
哺乳類の中枢時計は脳視床下部の視交叉上核に存在し、約2万個の神経細胞が階層的なネットワークを形成する。個々の細胞における概日リズム発振のメカニズムは、時計遺伝子発現の転写翻訳ループが想定され、詳細な分子機構の解明か急速に進んでいる。一方で、神経細胞集団レベルで出現する機能やそのネットワークの作動メカニズムについては殆ど分っていない。本研究課題では、これまで独自に開発した長期蛍光タイムラプスイメージング法により、神経細胞ネットワークにおける概日カルシウムリズムを“高空間分解能”かつ“網羅的”に可視化解析することで、概日リズム中枢を司る神経細胞ネットワークの作動基盤を解明する事を目指している。前年度までに時計遺伝子発現とカルシウムリズムを１細胞レベルで同時計測する多色イメージング計測を可能とした。
本年度は、Cre-LoxP組み替え法を用いた細胞種特異的な神経ネットワークの計測法を確立した。神経ペプチドを発現する細胞に組み替え酵素Creを発現する遺伝子改変マウスを用い、マウスから視交叉上核の組織培養切片を作成し、アデノ随伴ウイルスによりCre依存的に高感度カルシウムセンサーを感染発現させることで、特定の神経細胞集団からのカルシウムリズムを計測することを可能とした。さらに異なる蛍光色のレポーターを用いることで、神経細胞ネットワーク全体の中での特定の細胞種の働きを選択的に可視化すること出来た。さらに得られた細胞種特異的なイメージングデータから、概日リズムの主要パラメーター（頂点位相・振幅・最低値・周期）を解析プログラムを用いて自動計算により求めて、その空間情報をマップとして表示することで、特定の細胞の空間的なリズムの差異を詳細に解析することができる。現在は、シグナル分子/受容体の阻害薬・促進薬を用いて、両者の時空間パターンの変化を観察している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
3カ年計画の２年目である本年度は、特定の細胞種からの概日カルシウムイメージングを達成し、神経細胞ネットワークにおける時空間的な差異を観察することを可能とした。これまでに、細胞種特異的な機能を示すプレリミナリーな実験データを得ており、同細胞種内でのリズム位相差や、細胞の微小区画でのカルシウムリズムなどを観察している。今後も計画通りに着実に実験を進めることで、細胞ネットワークとしての機能を明らかに出来ると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに、時計遺伝子とカルシウムの時空間パターンの差異（初年度）、特定の細胞種からのカルシウム変動を観察しており（２年次）、生物時計中枢の細胞ネットワークの差作動基盤解明を目指して、今後は特にこれらのイメージングデータの詳細な解析を進めて行く。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成26年度では、29,471円の未使用額が発生した。これは平成26年度末に購入した物品の支払が平成27年4月に支払われる為の他、米国出張費の返納金が発生し年度末に返金された為に生じたものである。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本年度の予算とあわせて、主に細胞培養ための消耗品として使用する。
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