新規CellKeyアッセイ法によるヘテロ二量体化受容体の特性解析ならびに薬物探索

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25860200
• 研究種目: 若手研究(B)
• 研究機関: 東京理科大学
• 研究代表者: 須藤 結香 東京理科大学, 薬学部, 助教 (70646695)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: オピオイド受容体 / カンナビノイド受容体 / GPCR / 二量体 / シグナル伝達

研究概要

オピオイド受容体をはじめとする二量体化受容体活性化の分子メカニズムを解明し、効果的な鎮痛作用を持つオピオイド製剤や二量体化受容体に活性を有する薬剤の組み合わせを探索することを目的とし、研究を行った。1年目は、二量体化受容体の活性のみを特異的にとらえ薬効評価を可能とするCellKeyシステムを用いて、評価方法の条件検討・最適化を行った。
まず、ヒトμ、δ、κオピオイド受容体ならびにヒトカンナビノイドCB1受容体クローンを用いて、単独受容体発現ベクターを作製した。それぞれのクローンベクターをHEK293細胞に導入し安定発現株を作成した後、CellKeyシステムを用いて特異的アゴニスト処置による濃度依存的なインピーダンス変化を検出し、受容体活性の評価法を確立・最適化を行った。加えて本邦で臨床に用いられているモルヒネ、フェンタニル、オキシコドン製剤について、各種受容体安定発現株への活性評価を行ったところ、オピオイド受容体のサブタイプごとで活性は異なり、またCB1受容体には活性は認められなかった。得られたインピーダンス波形はGi/o共役型と推定される上向き形状を示し、Gi/o蛋白質シグナル特異的阻害剤であるPTX（百日咳毒素）で完全に抑制された。
さらに各クローンベクターを一過性に発現させた細胞でもCellKeyを用いた受容体活性が評価できるかを試みたところ、COS7細胞に一過性に発現させた各受容体の活性アゴニスト依存的に検出することができた。加えて、Gi/o以外の共役受容体活性についても同様に検出可能であった。以上、安定発現細胞に加え一過性発現細胞でも受容体活性を評価できるアッセイ系を構築できた。一過性発現細胞アッセイ系は、解析したい受容体の安定発現細胞を作成することなく用いることができるため、解析したい受容体の組み合わせを自由に選択でき、今後の研究の幅が拡がるものと期待される。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

1年目の課題であるCellKeyを用いた測定条件の最適化について、検討項目であったホスト細胞腫の選択、細胞数、プレートのコーティング条件の最適化をすべてクリアーすることができた。加えて、安定発現細胞株だけでなく一過性発現細胞においても、細胞種・細胞数・遺伝子導入条件等を検討した結果、一過性発現細胞を用いてCellKeyアッセイが可能となる条件を設定できた。本システムを用いることでさらに研究は加速化されると確信する。

今後の研究の推進方策

初年度に確立・最適化した二量体化オピオイド受容体の機能評価方法を用いて、実際にヘテロの二量体化受容体発現ベクターを構築し、CellKeyシステムで評価可能な細胞株を作製する。初年度において得られた単量体受容体発現株と比較し、異なる反応を示す薬物の同定を行う。また独自に開発した、一過性発現細胞アッセイ系を用いて、既存のオピオイド製剤に加え、新規骨格を有するオピオイド受容体作動薬（研究協力者より譲渡いただく）、ならびに近年論文で報告のあった二量体化受容体特異的アゴニストについても、単量体受容体との活性比較を行う。
さらに一過性発現細胞系を用いることで可能となる、他のGPCRの組み合わせや特異的化合物の候補を解析し、新たな二量体化受容体を同定できれば、従来用いられている既存の受容体活性評価法と合わせ、二量体化受容体の総合的なシグナル解析を行っていく。

次年度の研究費の使用計画

本研究課題において今年度使用した消耗品の該当金額はおおむね妥当であった。
消耗品の単価が高額のために端数が生じてしまったため、次年度に繰り越しとした。
次年度分の使用額として本年度繰り越した金額を合計しても、翌年度分使用予定の金額と大差はなく、当初の計画申請書通り、主に受容体アゴニスト・アンタゴニスト、シグナル阻害剤等の試薬類と、薬効評価系に必要なCellKey専用プレートの購入に使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] The endocannabinoid anandamide inhibits voltage-gated sodium channels Nav1.2, Nav1.6, Nav1.7, and Nav1.8 in Xenopus oocytes. (2014)
  • 著者名/発表者名: Dan Okura, Takafumi Horishita, Susumu Ueno, Nobuyuki Yanagihara, Yuka Sudo, Yasuhito Uezono,Takeyoshi Sata.
  • 雑誌名: Anesthesia & Analgesia 巻: 118(3) ページ: 554-62
  • DOI: 10.1213/ANE.0000000000000070.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel Delta Opioid Receptor Agonists with Oxazatricyclodecane Structure. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hideaki Fujii, Kohei hayashida, Akiyoshi Saitoh, Akinobu Yokoyama, Shigeto Hirayama, Takashi Iwai, Eriko Nakata, Toru Nemoto, Yuka Sudo, Yasuhito Uezono, Mitsuthiko Yamada, Hiroshi Nagase.
  • 雑誌名: ACS Medicinal Chemistry Letters 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1021/m1400491k
  • 査読あり
• [雑誌論文] New cancer cachexia rat model generated by implantation of a peritoneal dissemination-derived human stomach cancer cell line. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kiyoshi Terawaki , Yumi Sawada , Yohei Kashiwase , Hirofumi Hashimoto , Mitsuhiro Yoshimura , Masami Suzuki , Kanako Miyano , Yuka Sudo , Seiji Shiraishi , Yoshikazu Higami , Kazuyoshi Yanagihara , Yoshio Kase , Yoichi Ueta , Yasuhito Uezono
  • 雑誌名: American Journal Physiology Endocrinology and Metabolism. 巻: 306(4) ページ: 373-87
  • DOI: 10.1152/ajpendo.00116.2013.
  • 査読あり
• [学会発表] 新規がん悪液質モデルラットでのグレリン抵抗性の発現および漢方薬六君子湯によるグレリンシグナルを介した症状改善効果 (2013)
  • 著者名/発表者名: 柏瀬陽平, 寺脇潔, 鈴木雅美, 宮野加奈子, 須藤結香, 白石成二, 樋上賀一, 加瀬義夫, 柳原五吉, 上園保仁
  • 学会等名: 第66回日本薬理学会西南部会
  • 発表場所: 福岡
  • 年月日: 20131116-20131116
• [学会発表] SREBP-1c IS REQUIRED FOR LIFE-LONG CALORIC RESTRICTION-INDUCED MITOCHONDRIAL BIOGENESIS IN WHITE ADIPOSE TISSUE OF MICE (2013)
  • 著者名/発表者名: Namiki Fujii, Naoyuki Okita, Yoshikazu Chujo, Takumi Narita, Masahiro Sakai, Yuka Sudo, Yoshikazu Higami.
  • 学会等名: APDO Symposium 2013
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20131012-20131013
• [学会発表] Autophagic flux is suppressed via ROS in differentiated and hypertrophic adipocytes. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yuhei Mizunoe, Kentaro Mikami, Naoyuki Okita, Tomohiro Narahara, Arisa Negishi, Miki Yoshida, Yuka Sudo, Yoshikazu Higami.
  • 学会等名: APDO Symposium 2013
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20131012-20131013
• [学会発表] オートファジーは脂肪細胞におけるアディポカイン分泌バランスを改善する (2013)
  • 著者名/発表者名: 須藤結香、水之江雄平、三上健太郎、奈良原誠大、根岸亜梨沙、吉田実樹、沖田直之、樋上賀一
  • 学会等名: 日本肥満学会・第18回アディポサイエンスシンポジウム
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 20130804-20130804
• [学会発表] 脂肪細胞におけるオートファジーの役割 (2013)
  • 著者名/発表者名: 水之江雄平、三上健太郎、沖田直之、須藤結香、樋上賀一
  • 学会等名: 日本基礎老化学会・第36回大会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 20130604-20130606
• [学会発表] カロリー制限がミトコンドリアおよび脂質代謝に及ぼす影響の経時的解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 土屋拓郎、沖田直之、須藤結香、樋上賀一
  • 学会等名: 日本基礎老化学会・第36回大会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 20130604-20130606
• [学会発表] Srebp-1c はカロリー制限（CR）による抗老化・寿命延伸効果に重要である (2013)
  • 著者名/発表者名: 成田匠、藤井波木、沖田直之、須藤結香、樋上賀一
  • 学会等名: 日本基礎老化学会・第36回大会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 20130604-20130606
• [学会発表] オピオイドリガンド新規スクリーニング法確立と同法を用いたδ受容体サブタイプとオピオイド受容体ヘテロダイマーの相関解析
  • 著者名/発表者名: 横山明信、須藤結香、平山重人、樋上賀一、藤井秀明、上園保仁
  • 学会等名: 第66回日本薬理学会西南部会
  • 発表場所: 福岡
• [学会発表] 新規肥満応答性E3ユビキチンリガーゼWWP1の脂肪細胞における機能解析
  • 著者名/発表者名: 鈴木裕規、永井恒、沖田直之、岡戸仁志、田川亮真、須藤結香、樋上賀一
  • 学会等名: 日本肥満学会・第18回アディポサイエンス・シンポジウム
  • 発表場所: 大阪