| 研究課題/領域番号 |
25860221
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 高崎健康福祉大学 |
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研究代表者 |
大森 慎也 高崎健康福祉大学, 薬学部, 助手 (10509194)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | GATA2 / Cebpa / BMMC / 脱分化 / 形質転換 / 転写因子 |
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| 研究概要 |
申請者は、マスト細胞における転写因子GATA2の役割を明らかにする為に、先行研究でマウス骨髄由来マスト細胞（BMMCs）を用いてGATA2の機能欠損を行い解析した。その結果、GATA2機能欠失BMMCs(G2ΔCF-BMMCs)は細胞内顆粒が消失し、未熟な骨髄球様の形態を呈していた。さらにCebpaや、M-/G-/GM-CSFRなどの発現上昇が認められた。
本申請課題では、より詳細に解析を進め、骨髄球系細胞の分化と細胞系列決定機構を明らかにする事を目的とした。平成25年度は性状解析を中心に解析を行った。まず、発現上昇が認められた受容体に対するサイトカインを添加し形質転換能の有無を検討した。G2ΔCF-BMMCsをIL3/GM-CSF/G-CSF存在下で培養したところ、Ly6G/Ly6CG両陽性となり、形態的に分葉核を有し、大腸菌貪食活性を有する機能的な好中球様細胞へと分化した。IL3/GM-CSF/M-CSF存在下では蛍光Beadsを貪食する機能的なマクロファージへと分化した。一方で、IL3とIL5存在下でSiglecF陽性の好酸球は認められなかった。以上の結果から、G2ΔCF-BMMCsは系統が制限された分化能を保持する脱分化した細胞であることが明らかとなった。
次に、脱分化の原因となり得る遺伝子を同定する為にRNA-Sequencing解析を行った。その結果、マスト細胞内顆粒に含まれる複数の遺伝子が大きく減少していたが、マスト細胞および他系統の分化進行に関与する転写因子に優位な発現変動は認められなかった。この結果から、GATA2機能欠失を介した脱分化の主な原因はCebpaの発現上昇である可能性が示唆された。またGene Ontology解析の結果「metabolic process」に分けられる遺伝子群が上昇しており、この結果は脱分化をサポートすると考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成25年度に予定していた①G2ΔCF-BMMCsの性状解析と②RNA-Sequencingによるトランスクリプトーム解析は予定通り実行し解析を進める事ができた。しかしながら、トランスクリプトーム解析に関しては、さらに詳細な解析が必要であり今後引き続き行いたいと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
１．GATA2の機能補完実験とCebpaの欠損実験
GATA2機能欠失がBMMC脱分化の直接の原因であるのかどうか確認する為に、レトロウイルスを用いて機能補完実験を行う。結果はフローサイトメトリーを用いた発現解析（c-Kit、FceRIa、Mac1、Gr1の発現の有無）とサイトスピン標本による細胞形態の観察によって評価する。また、BMMCsの脱分化にはC/EBPaの発現上昇が必要であるか否かを調べるために、CebpaとGata2の二重欠損BMMCsを作製する。初年度からはじめていたマウスの交配は順調に予定通り進行しており、作出され次第解析を行う予定である。
２．GATA2によるCebpa遺伝子制御解析
これまでに、Cebpa遺伝子の発現制御は①Promoterのメチル化(Ruscio et al., 2013)、②IKAROSを介した3’UTRのクロマチン修飾(Rao et al., 2013)、③骨髄球の細胞株である32Dcl3細胞における+37Kエンハンサーを介したRUNX1による正の制御(Guo et al., 2012)が報告されている。申請者は、まず③に着目しその配列を調べた結果、RUNXの他にGATAとEtsの結合配列があることを見いだした。BMMCsでRUNX1、GATA2、PU.1のChIP assayを行った結果、3因子の結合が認められた。従ってこの3因子を中心に、re-ChIP assayや3C assay、Reporter assay等を駆使し、引き続きGATA2によるCebpa転写抑制メカニズムの解析を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
平成25年度に行ったRNA-Seq解析の外部委託解析、および新たなChIP-Seq解析を行う為のサンプル調整に要する期間が年度を越えたため、平成26年度に繰り越した。
平成25年度に行ったRNA-Seq解析のデータ処理（外部委託解析）を行う。またGATA2ノックアウトマウスからBMMCを樹立し、ChIP-Seq解析（外部委託解析）を行う事で、マスト細胞における直接のターゲット遺伝子を網羅的に同定する。
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