ES細胞におけるMax非結合型c-Mycによるアポトーシス誘導機構の解明

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25860244
• 研究種目: 若手研究(B)
• 研究機関: 埼玉医科大学
• 研究代表者: 平崎 正孝 埼玉医科大学, 医学部, 助教 (10522154)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: c-Myc / N-Myc / mouse ES / Max / Nanog / アポトーシス

研究概要

転写因子c-MycとNanogが、protein interactionを示す事は、HEK293細胞への共導入後の、共免疫沈降によって見出していた。そこで、まず、ES細胞を用い内在性のc-MycとNanogが、protein interactionを示すかを調べた、その結果、Nanogは、c-MycとのみならずN-Mycともprotein interactionを示す事が見出された。c-, N-MycはMaxと複合体を形成する事で機能するが、Nanogとの相互作用は、Max非依存的であった。
Nanogがc-Mycのどの領域に結合しているかを調べた。HA tagged c-Myc deletion formが挿入されているプラスミドベクターを作成した。そのHA-c-Myc deletionベクターとFlag-NanogベクターをHEK293細胞へ共導入し、共免疫沈降によって結合の有無を調べた。その結果、Nanogは、c-MycのN末端に結合している事が見いだされた。
非ステロイド性の抗エストロゲン剤であるタモキシフェンで活性が調節できるc-MycERをES細胞へ導入し、安定株を樹立した。その細胞株にタモキシフェンを添加すると、劇的な細胞死を示し、アポトーシスを起こしている事が見いだされた。しかし、その細胞死はN末端を欠失させると抑制された。
c-MycがNanogのどの領域に結合しているかを調べた。Flag tagged Nanog deletion formが挿入されているプラスミドベクターを作成した。HA-c-Myc ベクターとFlag-Nanog deletionベクターをHEK293細胞へ共導入し、共免疫沈降によって結合の有無を調べた。しかし、明確に結合領域を決定する事は出来なかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

c-MycがNanogのどの領域に結合しているかを決定できなかった。しかしながら、Nanogがc-MycのN末端に結合する事や、高活性状態のc-, N-MycによるES細胞におけるアポトーシスは、N末端が必須であることを見出した。

今後の研究の推進方策

c-MycがNanogのどの領域に結合しているかを、Nanogのdeletion formを作成する事では決定できなかった。そこで、Yeastのtwo-hybrid法を用い、c-Mycと結合できないNanogをスクリーニングする。
ES細胞にc-MycERを導入した細胞株は、タモキシフェン添加時にアポトーシスを示すが、強発現Nanogによって抑圧されるか調べる。
Max欠損ES細胞では、未分化の維持が損なわれる事とアポトーシスが起こる事を報告した。Esrrbは、ES細胞の自己複製に必要であり、iPS誘導を促進させる事が報告されている。Esrrbを強制発現させたMax欠損ES細胞でも、アポトーシスが抑制され長期的な培養が可能となることがわかった。そこで、①強発現EsrrbによってMax欠損ES細胞が示す未分化マーカーのタンパク質量・遺伝子発現の減少は抑圧されるのかを調べる。②分化マーカーの発現誘導も抑圧するのかを調べる。③強発現EsrrbによってMax欠損ES細胞が示すアポトーシスを抑制する事はTUNEL解析で見出した。そこで、更に活性化型カスパーゼ３と、DSBsの指標でもあるγH２AXも減少しているか調べる。
Max欠損ES細胞の示すアポトーシスは、NanogまたはEsrrbの強発現によって抑制された。Max欠損ES細胞株が示すアポトーシスの原因はMax非結合型c-Mycであると考えている。そこで、１つの可能性としてNanogまたはEsrrbの強発現によるMax欠損ES細胞のアポトーシスの抑制は、NanogやEsrrbのそれぞれが、独自にc-Mycと結合するために、Max非結合型c-Mycの減少によってアポトーシスは抑制されている可能性を考えた。それ故、EsrrbもNanog同様c-Mycと直接相互作用しているのかを調べる事にする。

次年度の研究費の使用計画

25年度の実験計画で示している、「c-MycとNanogが直接相互作用する領域の決定」において、申請時の予想では、もう少し条件検討に時間と、予算がかかる事を予想していたが、思った以上にスムーズに結果が出たため。また、上記計画以外にも、概ね実験がスムーズに進んでいるため。
26年度の実験計画では、Esrrbとc-Mycタンパクの相互作用を調べる事を主題にしている。c-Mycに対する標的タンパクが、前年のNnogと異なりEsrrbである事から、抗体等の条件検討に予算がかかる事が予想される。それを見越して申請していたが、前年までスムーズに進んでいたペースが保たれるかはわからない事もあり、前年度分と合わせた助成金を請求した。

研究成果

• [雑誌論文] Striking similarity in the gene expression levels of individual Myc module members among ESCs, EpiSCs, and partial iPSCs. (2013)
  • 著者名/発表者名: Hirasaki M, Hiraki-Kamon K, Kamon M, Suzuki A, Katano M, Nishimoto M, Okuda A.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 8 ページ: e83769
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0083769. eCollection 2013
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of Ccr4-Not Complex Components as Regulators of Transition from Partial to Genuine Induced Pluripotent Stem Cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kamon M, Katano M, Hiraki-Kamon K, Hishida T, Nakachi Y, Mizuno Y, Okazaki Y, Suzuki A, Hirasaki M, Ueda A, Nishimoto M, Kato H, Okuda A.
  • 雑誌名: Stem Cells Dev. 巻: 00 ページ: 1-10
  • DOI: 10.1089/scd.2013.0326
  • 査読あり
• [雑誌論文] In vivo function and evolution of the eutherian-specific pluripotency marker UTF1. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishimoto M, Katano M, Yamagishi T, Hishida T, Kamon M, Suzuki A, Hirasaki M, Nabeshima Y, Nabeshima Y, Katsura Y, Satta Y, Deakin JE, Graves JA, Kuroki Y, Ono R, Ishino F, Ema M, Takahashi S, Kato H, Okuda A.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 8 ページ: e68119
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0068119. Print 2013
  • 査読あり
• [学会発表] Strict conservation of expression levels of individual Myc module genes between ESCs and EpiSCs (2013)
  • 著者名/発表者名: Masataka Hirasaki, Miyuki Katano, Ayumu Suzuki, Masazumi Nishimoto, Akihiko Okuda
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会
  • 発表場所: 兵庫県神戸市・神戸ポートアイランド
  • 年月日: 20131201-20131201
• [学会発表] Mycモジュール遺伝子群はES細胞とEpiblast幹細胞の両者で高い発現の類似性を示す (2013)
  • 著者名/発表者名: 平崎 正孝、片野 幸、 鈴木 歩、 西本 正純、 奥田 晶彦
  • 学会等名: 第11回RCGMフロンティアシンポジウム
  • 発表場所: 埼玉県日高市・埼玉医科大学 ３０周年記念講堂
  • 年月日: 20131122-20131123