| 研究課題/領域番号 |
25860329
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
金 玄 国立感染症研究所, その他部局等, 研究員 (90648817)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 結核菌 / DNAジャイレース / 薬剤耐性菌 / ニューキノロン / X線回折 / 立体構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ニューキノロン耐性結核菌の遺伝子変異検出を基盤とした迅速なニューキノロン感受性試験を可能とするために、ニューキノロンのターケットである結核菌のDNAジャイレース上のアミノ酸置換とニューキノロン耐性との関係を明らかにすることで結核菌由来DNAジャイレースの立体構造解析から、新規抗結核薬の開発につながる新規キノロン誘導体のデザインを最終的な目標としている。
平成26年度は以下の3つの研究を行った。
1) 野生型組換えDNAジャイレースの酵素活性：25年度より得られた野生型(H37Rv, Osaka株)の組み替えDNAジャイレースを用いて酵素活性の条件を検討させた。DNAジャイレース活性にはRelaxed plasmid DNA 及び Supercoiled plasmid DNAが必要であり、それぞれのプラスミドを用いたSupercoiling assay 及び Cleavage assayを行った。その結果、この組み替えDNAジャイレースはDNAジャイレース活性を持つことをin vitroで確認した。
2) 変異型組み替えDNAジャイレース遺伝子のクローニング及び発現と精製：平成25年度より得られた野生型の組み替え DNAジャイレース(H37Rv, Osaka株)の遺伝子を元にし、site-direct mutagenesis方法を用いて遺伝子変異を作成し、発現と精製を行った。
3) 組み替えDNAジャイレースの結晶化：平成25年度より得られた野生型組み替えDNAジャイレースの結晶化のスクリーニングを行い,いくつかの結晶が得られてこの結晶を用いて高エネルギー加速器研究機構においてX線回折データの収集を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1) 野生型及び変異型の各タンパク質については活性を十分調べる濃度まで精製できた。
2) 組み替えDNAジャイレースの結晶化：平成26年度に得られた結核菌北京型 (osaka株) 由来DNAジャイレースA (GyrA) のN末部分 (502残基分) 結晶を用いて高エネルギー加速器研究機構においてX線回折データの収集を行った。回折データから結晶学的諸性質と統計値を求めた結果、得られた結晶は立体構造の決定に適していることが示された。そこで、すでに報告されている結核菌基準株 (H37Rv株) 由来GyrA (N末部分) の構造情報を用いて、分子置換法によるosaka株由来GyrA (N末部分) の立体構造決定を行った。最終的にosaka株由来GyrA (N末部分) の立体構造を決定した。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度は以下の2つの研究を進める。
1) 野生型及び変異型組み替えDNAジャイレースの酵素活性及び阻害実験：平成25年度と26年度より得られたそれぞれの組み替えDNAジャイレースを用いて酵素活性及びキノロンに対する阻害実験を行う。それで野生型と変異型の活性及びどんなメカニズムで阻害が出来るかを明らかにする。
2) DNAジャイレースとニューキノロン剤との共結晶化：平成26年度で得られた結晶の条件を用いてosaka株由来DNAジャイレースとニューキノロン剤との共結晶ができる条件を検討させる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成27年度はDNAジャイレース活性及びキノロンが入った阻害実験を行う予定である。このDNAジャイレースの活性及び阻害実験に必要な試薬(Relaxed DNA, supercoiled DNA, キノロン剤など)が高いことで平成26年度の研究費から少し残した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度研究費は、平成26年度に残った分と合わせてDNAジャイレースの酵素活性及びタンパク質とキノロンとの共結晶かに必要な試薬及び消耗品などの購入に使用する。さらに解析データ取得実験のため放射光科学施設への旅費、成果発表及び情報収集のための国内及び海外学会への参加費と旅費、また論文出版のための経費に使用する予定である。
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