| 研究課題/領域番号 |
25860349
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| 研究機関 | 独立行政法人国立がん研究センター |
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研究代表者 |
中原 知美 独立行政法人国立がん研究センター, 研究所, 研究員 (60601177)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | パピローマウイルス / 子宮頸がん / NFkB / ATR |
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| 研究実績の概要 |
1.E1-NFkB負のフィードバック機構の解明
申請者らは、HPV16ゲノムを維持複製する細胞に、外来性プロモーターよりE1発現を誘導するとNFkBが活性化され、このNFkBの活性化はウイルスゲノム複製を抑制することを見出した。さらに、NFkB活性化によるウイルスゲノム複製抑制のメカニズムのひとつとして、E1のプロテオソーム分解の促進が関与することを明らかにした。当該年度においては、HPV感染患者由来でHPV31ゲノムをエピゾームとして維持する細胞株や、申請者らが作製したHPV16ゲノムを維持する細胞を、NFkB活性化を誘導するTNFa等に暴露すると、ウイルスゲノムコピー数が減少することを見出した。さらに、HPVゲノムを維持する細胞では、親細胞と比べNFkBの活性が高く維持されていることを見つけた。また、E1によるNFkB活性化は、宿主のDNA損傷修復機構において中心的な役割を果たすATRの活性化を介すること、HPVゲノム維持細胞ではATRが恒常的に活性化していることが示された。つまり、HPV持続感染の背景には、E1によるATR-NFkB活性化と、それらによるゲノム複製の抑制という負のフィードバックが関与する可能性を示した。
2.HPV持続感染おける維持複製をモニターできるレポーターウイルスゲノムの作製
HPV維持複製を制御する宿主因子を網羅的に解析するため、レポーター遺伝子を搭載したHPV16ゲノムを作製して評価した。レポーター遺伝子として分泌型ルシフェラーゼを用い、培養上清中のルシフェラーゼ活性を測定した。結果、100細胞程度（1細胞あたり1コピーのウイルスゲノム）の培養上清からでも十分に検出できる感度の高いレポーターゲノムの作製に成功した。当該年度は、このレポーターゲノムを、長期的に安定して維持できる子宮頸部角化細胞の樹立に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究は、HPV持続感染を制御する宿主因子の同定を目的としている。当該年度までに、HPV持続感染細胞ではATRおよびNFkBが活性化していること、これらの活性化は、HPVゲノム複製を抑制する負のフィードバックとして機能することを明らかにできた。さらに、NFkB活性化がウイルスゲノム複製を抑制するメカニズムのひとつとして、E1のプロテオソーム分解促進を示した。申請者らの以前の研究では、HPV持続感染細胞におけるウイルスゲノムの複製は、E1に依存する場合とそうでない場合のどちらもありうることが示されている。NFkB活性化によるウイルスゲノム複製の抑制は、E1依存的な複製においてのみ有効である可能性が高く、当初期待したE1非依存的な複製に対するゲノム複製の制御機構の解析は、今後の課題として残った。現在までに、HPV持続感染細胞におけるE1発現の有無を検出できる高感度な特異抗体は開発されていない。本研究成果から、E1はATRを介してNFkBを活性化することが明らかとなったことから、実際の感染組織の基底細胞においてゲノム複製がE1による場合とそうでない場合の判別に、ATRやNFkB活性化を指標とできることが期待される。
前年度の課題であった、レポーター遺伝子を搭載したHPV16ゲノムを同程度のコピー数のエピゾームとして長期的に維持する子宮頸部角化細胞の樹立に成功した。このレポーターゲノムには薬剤耐性遺伝子は搭載しておらず、従って、今後のHPV複製阻害薬スクリーニングにより適した細胞であると考えられる。この維持細胞にインターフェロンやTNFaを処理すると、野生型と同様にゲノムコピー数が減少した。しかし、コピー数の増減と培養上清中のルシフェラーゼ活性が相関しないケースが散見された。
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| 今後の研究の推進方策 |
現行のレポーターHPV16ゲノムは、動物細胞における高いレポーター発現を期待して、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子の発現にCMVプロモーターを用いている。CMVプロモーターは、NFkB活性に影響されやすく、NFkB活性化を誘導する宿主因子の評価には適さない。今後の研究の推進方策としては、現行のレポーターゲノムを雛形として、CMVプロモーターを種々の他のプロモーターと交換し、(1)低コピー数のエピゾームゲノムからも検出が可能な程度にレポーター遺伝子を発現することのできるプロモーターの探索 (2)レポーター遺伝子の発現が、CMVプロモーターに匹敵するプロモーターが見つからない場合、各種プロモーター由来のレポーター遺伝子の発現は、HPVゲノムコピー数がどの程度であれば可能かどうかの検討 (3) スクリーニングの目的に応じて(1),(2)レポーターゲノムを使い分けることにより、目的遺伝子の検索を進める。近年、DNA損傷応答系の活性化は、IFN産生を促すことが報告された。申請者らの予備的実験から、HPV16ゲノム維持細胞に、DNA損傷応答系の活性化を誘導すると、NFkBの活性化だけでなく、一部のIFN stimulated genesの発現上昇が観察された。IFNのみの効果と、DNA損傷応答系の活性化、およびNFkB活性化などの種々の刺激において発現誘導されるIFN simulated genesの異同や、それらのHPVゲノム複製に対する効果を合わせて検討し、HPVゲノム複製をより効果的に抑制できる宿主因子の同定を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、研究成果(1)(2)それぞれの学術専門誌の発表を予定して、昨年度からの繰り懲り額を使用する予定であった。(1)は掲載されたが、(2)はいまだ投稿準備中であるため、(2)の掲載にかかわる費用分が繰り越しとなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
昨年からの繰越額は、研究成果(2)の専門誌掲載にかかわる費用として使用する予定である。平成27年度の交付金については、当初の計画通り、スクリーニングに必要な細胞培養試薬や、ライブラリーの作製等として使用する。また、一部は、スクリーニング実施をアシストする研究補助要員等の人件費として使用する。
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