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BDNF定量条件の検討：ラットC6細胞からmRNAを抽出し、BDNF Exon1およびCoding Sequence(CDS)のプライマーを用いてReal Time PCRを行い定量条件の検討を行った。CDS（BDNFの全てのTranscript variantsに共通の配列）に比べ、Exon1の発現量は非常に少なく（およそ1/100以下）、定量性に欠けるという結果となった。
ハウスキーピング遺伝子（Cyclophilin B（CPB））の定量条件の検討（Real Time PCR）：定量は再現性あり、コントロールとして使用する予定としている。
siRNAの検討：siRNAポジティブおよびネガティブコントロールを購入し（Dharmacon社）、これらを用いたトランスフェクション条件の検討を行った。具体的にはsiRNA量、細胞数、トランスフェクション試薬量、無血清培地での洗浄、siRNA暴露時間などの条件を検討し、コントロールCPBに対するsiRNA効果を確認した（50%ノックダウン）。一方、Exon1に対するsiRNAターゲット配列はSIGMA社に設計を依頼し、3つのターゲット領域を得た。しかし、C6細胞から得られるExon1は低濃度であり、siRNAによるノックダウン効果を検討するには定量精度が低かった。そこでBDNF transcript variant Iをクローニングし、細胞へのトランスフェクションによるBDNF過発現細胞を作成することになった。
BDNFクローニング：ラット脳からmRNA抽出した後、BDNF transcript variant I (4252bp) のうち、Exon1とCDSを含む1410bpの遺伝子クローニングを試みた。プラスミドベクターpcDNA3.1(+)へ挿入するため、BDNF transcript variant Iの5’末端にBamHIサイト、CDS領域の3’末端にEcoRIサイトを接着したプライマーを設計し、目的とするBDNF transcript variant Iを得た。
今後はBDNF過発現細胞を作成し、siRNAの効果を確認した後、shRNAおよびアデノ随伴ウイルスベクターを用いたshRNA発現系を作成し、in vivoで検討を行う予定である。
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