研究課題
若手研究(B)
TNF、LTα, LTβ は炎症・組織修復や腫瘍化などの多くの生命現象・病態に関わる代表的な炎症性サイトカインである。なかでもLTβはウイルス感染肝細胞や一部の肝細胞癌で発現を認めるほか、肝特異的にLTβを発現させたマウスで肝炎・肝細胞癌が発生することから、肝炎・肝細胞癌の誘導因子として近年注目されている。LTβが属するTNFファミリーの遺伝子は、隣接して6番染色体上のTNF/LT遺伝子座に存在し、遺伝子クラスターを形成している。遺伝子クラスターからの発現制御には、CCCTC-binding factor (CTCF) により形成されるDNA制御配列の3次元的な位置関係、言い換えれば、エピゲノム情報である高次クロマチン構造が重要である。我々はクロマチン免疫沈降-DNAチップ/シークエンスの網羅的解析データに基づき、TNF/LT遺伝子座のCTCFタンパク質の結合部位(TC配列)、および周囲の遺伝子の発現を増強するエンハンサー配列(TE配列)を同定した。またChromosome Conformation Capture (3C) 法を用いて、CTCFを介したDNA制御配列の3次元的な位置関係、すなわち高次クロマチン構造が、肝細胞におけるTEエンハンサーとLTβプロモーターとの相互作用を制御し、LTβの発現調節に重要な役割を果たすことを明らかにした。しかし、これら高次クロマチン構造などのエピゲノムを変化させるメカニズムは未だ不明である。そこで本研究では高次クロマチン構造の変化に関与しLTβ 発現を制御する分子メカニズムを明らかにし、新規病態診断法の開発や、LTβ 遺伝子発現の調節を目的とした“エピジェネティック治療薬”の開発を目指す。
2: おおむね順調に進展している
1.高次クロマチン構造変化のメカニズムの解明CTCFの翻訳後修飾はリン酸化、アセチル化、ポリADPリボシル（PAR）化などが知られているが、これらの翻訳後修飾はNFκBシグナリングとも密接な関係があり、TNF刺激の下流ではCTCFの修飾状態が変化している可能性がある。これらを検出するため、抗CTCF抗体を用いて荷電および質量によるタンパク二次元電気泳動法であるAuto-2D法、およびプロテオミクスを用いてCTCFの翻訳後修飾を網羅的に解析した。また、各種阻害薬や刺激物質がTNF/LT遺伝子座の遺伝子発現と高次クロマチン構造に与える影響を、定量的逆転写PCR法および3C法を行い検討した。その結果NFκB、PARPなど複数の因子が、実際に高次クロマチン構造や遺伝子発現パターンに影響を与えていることが判明した。現在は翻訳後修飾を含め引き続き解析を進めている。これらの因子は高次クロマチン構造を制御しLTβの発現を調節する“エピジェネティック治療薬”の創薬の標的となりうる。2. 高次クロマチン構造に影響を与える因子の検索慢性肝炎では高次クロマチン構造の変化が遷延すると考え、培養細胞を用いて持続的な炎症刺激の有無による高次クロマチン構造への影響を検討した。その結果、持続的な刺激の有無により、追加刺激に対する反応および高次クロマチン構造の変化パターンが異なることが分かった。さらに阻害薬やsiRNAによるノックダウンを用いた実験から、高次構造の変化のトリガーとなる候補分子が挙げられた。現在更なる解析を進めている。
＜脂肪肝炎からの肝発癌におけるLTβの関与の検討＞ 我々は、LTβがﾋﾄ肝癌組織で発現することを明らかにした。さらに追加実験により、脂肪肝炎など一部の脂肪肝組織でもLTβが発現する状況があることが分かった。脂肪肝炎由来の肝発癌はその患者数の多さから現在注目されている現象であるが不明な点が多く、その機序の解明は社会に大きく寄与すると考える。そこで脂肪肝におけるLTβ発現の解析も併せて行う。培養肝細胞にｵﾚｲﾝ酸を負荷し脂肪蓄積したものを解析する。＜in vivo 3C法の確立・臨床応用＞ これまでin vitroで得られた結果がin vivoにも適応しうるか確認するため、まずﾏｳｽ肝を用いてin vivo 3C法を確立する。具体的には、肝組織のﾎﾙﾏﾘﾝ固定、ﾎﾓｼﾞﾅｲｽﾞ、核抽出を行い、すでに確立したin vitroでの手法を調整し最適化する。3C法で最も肝要であるprimerのﾃﾞｻﾞｲﾝがﾏｳｽTNF/LT遺伝子座で難航する場合には、Russian Academy of Science のDr. Sergei A. NedospasovにTNF/LT 遺伝子座をﾋﾄ化したﾄﾗﾝｽｼﾞｪﾆｯｸﾏｳｽを使用させて頂く了解を得ており、そのﾏｳｽを用いて、既に使用しているﾋﾄTNF/LT遺伝子座用の3C primerが使用して実験を遂行する。一般に肝障害や肝部分切除後にはLTβが発現し肝細胞増殖・肝再生を誘導することから、ﾏｳｽを対象として肝部分切除を行いLTβの発現を誘導し、生体内でのTNF/LT遺伝子座の高次ｸﾛﾏﾁﾝ構造の変化をin vivo 3C法を用いて解析する。ここで得られたﾃﾞｰﾀを参考に、肝炎・肝発癌ﾓﾃﾞﾙﾏｽｽのTNF/LT遺伝子座の高次ｸﾛﾏﾁﾝ構造をin vivo 3C法で解析し、LTβを介した癌化の予測が可能かを検討する。また先の実験により同定したｼｸﾞﾅﾙや修飾を阻害することで高次構造を変化させうるか、それによりLTβの発現を調節できるかをin vivo 3C法で検討する。最終的にLTβ陽性のﾋﾄ慢性肝炎および肝癌に対して、高次ｸﾛﾏﾁﾝ構造を制御しLTβの発現を抑える薬剤を作成し、ﾋﾄ肝疾患の新たな治療法の開発を目指す。
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特集／肝胆膵領域におけるNF-κB研究の最前線 肝胆膵
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