研究課題
膵臓癌は毎年新たに約23,000人が診断され、従来の手術、化学療法、放射線治療に抵抗性を示すため極めて予後不良の悪性腫瘍である。さらに、膵臓癌は現在の診断技術では早期発見が難しいため進行期で診断されることが多く、近年増加傾向にある事からも、膵臓癌に対する新規治療法の開発が早急に望まれている。本研究の目的は申請者らが確立した細胞表面膜タンパク質に対する定量的プロテオミクス手法を用いて膵臓癌の抗体医薬品開発の標的となる癌抗原を同定し、腫瘍の増殖との関係の解明及び癌抗原に対するモノクローナル抗体の開発と動物モデルでの抗腫瘍効果を証明することである。本年度において、申請者等は定量的プロテオーム解析を行う事で正常ヒト膵臓皮細胞と比較して、膵臓癌細胞株にて高発現する膜タンパク質のスクリーニングを行った。膵臓癌細胞株として、AsPC1、BxPC3、Capan-1、 Capan-2、MIAPACA2、PANC1、Suit2の7種類、コントロール細胞として、正常ヒト膵臓上皮細胞を用いて細胞表面膜タンパク質のビオチン標識とアビジンビーズによる濃縮、トリプシン消化した後、iTRAQ試薬によるペプチドの標識と質量分析計による測定により、各種細胞における細胞表面膜タンパク質の網羅的な定量解析を行った。その結果、767種類のタンパク質を同定し、262種類(34.16%)の細胞表面膜タンパク質が含まれていた。同定されたタンパク質の中には正常ヒト膵臓皮細胞と比較してAsPC1、BxPC3などにおいて高発現する分子が認められた。この分子が癌細胞表面に発現していることをFACS解析によっても確認した。さらに、膵臓癌組織中に本癌抗原が高発現することも明らかにした。本癌抗原に対するマウスモノクローナル抗体を18クローン取得することに成功し、抗体の詳細な性質を検証中である。
2: おおむね順調に進展している
正常ヒト膵上皮細胞と7種類の膵臓癌細胞株との間で細胞表面膜タンパク質をisobaric tag for relative and absolute quantitation (iTRAQ)法により網羅的に定量解析することにより、膵臓癌抗原候補タンパク質を複数種類同定した。これらの癌抗原候補タンパク質の内、1つの分子について発現をウェスタンブロット法およびFACSで検証した結果、AsPC1、BxPC3、PANC1において細胞膜に発現することを明らかにした。siRNAを用いて本分子の発現を抑制させることで癌細胞の増殖抑制効果が認められたことから本分子が癌細胞の増殖と関与することが明らかとなった。さらに、膵臓癌臨床検体を用いた免疫組織化学染色法により、癌抗原候補分子が膵臓癌組織中において高発現することを証明し、治療標的となり得る事を示した。本癌抗原分子に対するマウスモノクローナル抗体の開発を試みた結果、複数クローンを18種類取得することに成功した。精製抗体について、抗体の詳細な性質を解析すると同時に、細胞増殖抑制効果を検討している。マウスゼノグラフトモデルに対する治療効果を証明するため、SCIDマウスを用いたゼノグラフトモデルの条件検討も完了済みで有り、有用な抗体を絞り込んだ後、抗腫瘍効果をin vivo実験により証明する。
本研究によりiTRAQ解析から同定された膵臓癌に対する癌抗原候補タンパク質の膵臓癌における機能についてsiRNAを用いた遺伝子発現抑制技術を用いて解析する。また、本癌抗原候補分子に対するモノクローナル抗体を独自に開発することに成功しており、表面プラズモン共鳴(SPR)測定により高親和性のクローンを選別する。フローサイトメトリーにより抗体の癌抗原との反応性も確認する。さらに、開発したモノクローナル抗体が癌細胞の増殖を直接阻害する活性を有するかどうかについて、細胞増殖アッセイを行う事で評価する。抗腫瘍活性を有するモノクローナル抗体を取得できればin vivoでの抗腫瘍効果を証明するためにモノクローナル抗体を大量精製し、免疫不全マウスの皮下に移植した膵臓癌細胞株のゼノグラフトモデルに対する抗腫瘍効果をコントロール抗体と比較することで検証する。
購入予定の薬品の在庫がなかったため。
次年度計画に組み込んで使用する。
すべて 2014
すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 1件)
Oncotarget
巻: 5 ページ: 7776-87
Methods Mol Biol.
巻: 1142 ページ: 99-110
10.1007/978-1-4939-0404-4_12
