心筋形質維持におけるNRSF転写抑制複合体によるエピゲノム制御の意義の研究

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25860596
• 研究種目: 若手研究(B)
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 桑原 佳宏 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 医員 (40647400)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: ノックアウトマウス / エピゲノム / 転写因子

研究概要

本研究では、最近申請者が作製に成功したNRSF心筋特異的ノックアウトマウスをはじめ、NRSFとの複合体形成が知られる複数のヒストン修飾因子のノックアウトマウスの解析と、その詳細な比較検討を行い、NRSF転写抑制複合体の心筋形質維持に係わる分子機序とその破綻のメカニズムを、特にエピゲノム制御の観点から明らかにし、新規心治療標的探索を行う。NRSFストレートノックアウトマウスは胎生期に死亡するため、心筋でのNRSFの転写・エピゲノム制御における意義を検討するために、まず本年度申請者はNRSF floxマウスを用いて、心筋特異的、及び時期特異的にNRSFを欠失するNRSF conditionalノックアウトマウスを作製した。具体的には、NRSFloxp/lopxマウスを、心臓特異的なalphaMHC-CREマウスおよび、薬剤誘導性alphaMHC-MerCREMerマウスと交配し、得られたマウスを解析した。その結果、NRSFloxp/loxp; alphaMHC-creマウスは正常に生まれてくるが、生後約10週までに徐々に進行する心機能低下を伴い、心室性頻拍などの不整脈が多発し、最終的に突然死する結果を得た。またDNAマイクロアレイなどの解析結果から、NRSFloxp/loxp; alphaMHC-creマウスでは、dnNRSF-Tgと同様複数の心筋胎児型遺伝子の発現が亢進していることも確認した。またNRSFloxp/lopx; alphaMHC-MerCREMerマウスも作成し、タモキシフェンを投与し、生後6-8週令で心臓におけるNRSFの発現量が野生型の約70％まで低下したマウスを得た。現在このマウスの心機能、生存率など解析中である。また申請者はヒストン脱アセチル化酵素HDAC1/2およびヒストン脱メチル化酵素LSD1のfloxマウスを入手し、それぞれ心筋特異的CREマウスとの交配を開始した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

NRSF floxマウスを用いて、心筋特異的、及び時期特異的にNRSFを欠失するNRSF conditionalノックアウトマウスの作製に成功し、その表現型の解析を開始した。具体的には、NRSFloxp/lopxマウスを、心臓特異的なalphaMHC-CREマウスおよび、薬剤誘導性alphaMHC-MerCREMerマウスと交配し、得られたマウスを解析した。その結果、NRSFloxp/loxp; alphaMHC-creマウスは正常に生まれてくるが、生後約10週までに徐々に進行する心機能低下を伴い、心室性頻拍などの不整脈が多発し、最終的に突然死する結果を得た。またDNAマイクロアレイなどの解析結果から、NRSFloxp/loxp; alphaMHC-creマウスでは、dnNRSF-Tgと同様複数の心筋胎児型遺伝子の発現が亢進していることも確認した。またNRSFloxp/lopx;alphaMHC-MerCREMerマウスも作成し、タモキシフェンを投与し、生後6-8週令で心臓におけるNRSFの発現量が野生型の約70％まで低下したマウスを得た。現在このマウスの心機能、生存率など解析中である。またはヒストン脱アセチル化酵素HDAC1/2およびヒストン脱メチル化酵素LSD1のfloxマウスを入手し、それぞれ心筋特異的CREマウスとの交配を開始しており、進捗状況はおおむね順調であると考える。

今後の研究の推進方策

今後の研究は以下のように推進方策は以下のとおりである。
１．NRSF conditionalノックアウトマウスにおける遺伝子転写・エピゲノム変化の解析。NRSF conditionalノックアウトマウスにおける上記解析を継続する。心筋特異的NRSFノックアウトマウスの解析の継続に加え、薬剤誘導性CREマウスを用いた時期特異的かつ心筋特異的NRSFノックアウトマウスの、心臓の各成熟過程、あるいは病的負荷時におけるNRSFの役割の解析を行っていきたい。
２．LSD1 conditionalノックアウトマウスおよびHDAC1/2ダブルconditionalノックアウトマウスにおける遺伝子転写・エピゲノム変化の解析。心筋特異的HDAC1/2ダブルconditionalノックアウトマウスおよびLSD1 conditionalノックアウトマウスの作成を継続し、解析を開始する。特に先行しているHDAC1/2ダブルconditionalノックアウトマウスにおいては、alphaMHC-CREとの交配、解析に加え、薬剤誘導性CREマウスとの交配による、時期特異的conditionalノックアウトマウスの作製と解析を行う。
３．NRSF複合体の機能を修飾する分子、および低分子化合物の同定･解析。エピゲノム制御におけるNRSFの機能、およびその修飾の分子機構を同定するために、yeat two-hybrid(Y2H)、NRSF依存性転写抑制活性を指標とするhigh throughput screening、またNRSFトランスジェニックを用いたtandem affinity purificationを行い、NRSFと複合体を形成したり、その転写・エピゲノム制御活性に影響を与えうる分子の新規同定の試みを開始したい。

次年度の研究費の使用計画

進捗状況はほぼ予定通りであるが、試薬の購入において当初の予定より若干購入費が少なかったために、次年度使用額が生じた。
次年度の研究遂行に必要な試薬購入費に充てる予定である。

研究成果

• [雑誌論文] The Effects of Super-Flux (High Performance) Dialyzer on Plasma Glycosylated Pro-B-Type Natriuretic Peptide (proBNP) and Glycosylated N-Terminal proBNP in End-Stage Renal Disease Patients on Dialysis. (2014)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa Y, Nishikimi T, Kuwahara K, Yasuno S, Kinoshita H, Kuwabara Y, Nakao K, Minami T, Yamada C, Ueshima K, Ikeda Y, Okamoto H, Horii K, Nagata K, Kangawa K, Minamino N, Nakao K
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 9 ページ: e92314
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0092314
  • 査読あり
• [雑誌論文] Angiotensin II Type 1a receptor signaling directly contributes to the increased arrhythmogenicity in cardiac hypertrophy (2013)
  • 著者名/発表者名: Yasuno S, Kuwahara K, Kinoshita H, Yamada C, Nakagawa Y, Usami S, Kuwabara Y, Ueshima K, Harada M, Nishikimi T, Nakao K
  • 雑誌名: Br J Pharmacol. 巻: 170 ページ: 1384-95
  • DOI: 10.1111/bph.12328
  • 査読あり
• [雑誌論文] Increased Expression of HCN Channels in the Ventricular Myocardium Contributes to Enhanced Arrhythmicity in Mouse Failing Hearts (2013)
  • 著者名/発表者名: Kuwabara Y, Kuwahara K, Takano M, Kinoshita H, Arai Y, Yasuno S, Nakagawa Y, Igata S, Usami S, Minami T, Yamada Y, Nakao K, Yamada C, Shibata J, Nishikimi T, Ueshima K, Nakao K
  • 雑誌名: J Am Heart Assoc. 巻: 2 ページ: e000150
  • DOI: 10.1161/JAHA.113.000150
  • 査読あり
• [雑誌論文] Direct Immunochemiluminescent Assay for proBNP and Total BNP in Human Plasma proBNP and Total BNP Levels in Normal and Heart Failure. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nishikimi T, Okamoto H, Nakamura M, Ogawa N, Horii K, Nagata K, Nakagawa Y, Kinoshita H, Yamada C, Nakao K, Minami T, Kuwabara Y, Kuwahara K, Masuda I, Kangawa K, Minamino N, Nakao K
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 8 ページ: e53233
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0053233
  • 査読あり
• [学会発表] 肺動脈性肺高血圧症に対する新規治療標的としてのTRPC3/6阻害効果の検討 (2013)
  • 著者名/発表者名: 木下秀之、桑原宏一郎、清中茂樹、森泰生、赤木達、中村一文、桒原佳宏、中川靖章、錦見俊雄、中尾一和
  • 学会等名: 第2回 日本肺循環学会学術集会
  • 発表場所: 東京
  • 年月日: 20130622-20130623
• [学会発表] 左室リモデリング進行及び催不整脈性抑制におけるレニンーアンジオテンシン系の検討 (2013)
  • 著者名/発表者名: 山田千夏、桑原宏一郎、木下秀之、錦見俊雄、中尾一泰、桒原佳宏、保野慎治、中川靖章、上嶋健治、中尾一和
  • 学会等名: 第86回 日本内分泌学会学術総会
  • 発表場所: 仙台
  • 年月日: 20130425-20130427
• [備考] 京都大学大学院医学研究科 内分泌代謝内科学 心臓グループ
  • URL: http://www.kuhp.kyoto-u.ac.jp/~med2/jpn/research/cardio.html