iPS細胞を用いた筋萎縮性側索硬化症治療薬のスクリーニング法の開発

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25860705
• 研究種目: 若手研究(B)
• 研究機関: 岐阜大学
• 研究代表者: 山田 恵 岐阜大学, 医学部附属病院, 助教 (50452157)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 筋萎縮性側索硬化症 / iPS細胞 / 歯髄細胞

研究概要

1.正常およびALS 患者のiPS 細胞の樹立
倫理委員会の承諾のもと、本学口腔病態学分野と連携し、正常例・ALS 患者の歯髄あるいは歯槽部骨膜の細胞からiPS 細胞を樹立した。1 例のALS 患者から歯髄組織幹細胞由来iPS 細胞を作成し、nude mice の精巣内に注入し、3 胚葉への分化を確認した。さらに、3例のALS 患者の歯髄組織由来幹細胞から樹立をすすめている。
2.正常およびALS 患者由来iPS 細胞から、運動ニューロンへ分化誘導
iPS 細胞から運動ニューロンへの分化については、ソニックヘッジホック作動薬とレチノイン酸を添加すると、神経細胞のマーカーであるTuj1 陽性細胞が突起を伴って出現し、うち約20％に運動ニューロンに特異的な転写因子であるHB9 の発現がみとめられる。既報のプロトコール（Bao-Yang Hu et al. nature protocols. 2009）に従い、iPS 細胞から運動ニューロンへの分化誘導系を構築したが、安定した手技を目指し、現在も検討中である。
また幸い、ALSのモデル犬が入手できたことから、犬モデルにおいても歯を抜いて歯髄細胞を分離、培養し、治療に使うことを検討中である。現段階では、健常犬の犬歯から歯髄組織を採取し歯髄細胞を樹立した。リアルタイムPCR法を用いて歯髄細胞における神経栄養因子のmRNAの発現を測定した。BDNF、NT-3、NGFをはじめとした多種の神経栄養因子が多量に発現していることを確認した。また、免疫組織学的検討では、神経系の前駆細胞にみられるマーカーが発現していた。また、歯髄細胞自体が神経系の細胞へ誘導されることも確認した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の予定通り、正常およびALS 患者のiPS 細胞の樹立を行い、正常およびALS 患者由来iPS 細胞から、運動ニューロンへ分化誘導についてもすすめている。
iPS細胞の樹立に関しては、正常例・ALS 患者の歯髄あるいは歯槽部骨膜の細胞からiPS細胞作製を行っている。ALS 患者から歯髄組織幹細胞由来iPS 細胞を作成し、nude mice の精巣内に注入したところ、3 胚葉への分化が確認され、多能性を示していた。
また、iPS 細胞から運動ニューロンへの分化については、既報のプロトコールに従い、iPS 細胞から運動ニューロンへの分化誘導をすすめている。培養・誘導法においての検討課題も多くみとめられており、より安定した手技・効率のよい誘導法を現在も検討中である。
加えて、ヒトのみならず、犬の歯髄由来細胞を用いた歯髄細胞の樹立もあわせて行っている。

今後の研究の推進方策

1.正常およびALS 患者のiPS 細胞の樹立
現在、3例のALS 患者の歯髄組織由来幹細胞から樹立を行っており、さらに症例数を増やしていく予定である。
2.正常およびALS 患者由来iPS 細胞から、運動ニューロンへ分化誘導
既報告のプロトコールに従い細胞の分化誘導をすすめているが、経験豊富な他施設の助言も頂きながら誘導法の改善を図っている。
同時に、より簡便に作成可能な犬モデルにおける歯髄細胞樹立をすすめている。我々は、ヒト遺伝性ALSの原因遺伝子であるSOD1に変異を持つコーギー犬（ALSモデル犬）を保有している。これまでの我々の研究では、歯髄細胞はNGFを含む多くの神経栄養因子を発現し、歯髄細胞自体も神経細胞へ誘導できることを確認している。また、犬脊損モデルにおける歯髄細胞移植の安全性を確認した。岐阜薬科大学と岐阜大学医学部、応用生物科学部とこれまで頻回に緊密に検討会を持ちながら研究を進めている。犬モデルでの技術・方法等をふまえ、ヒトへの応用をすすめる予定である。

次年度の研究費の使用計画

当初の計画通り研究自体はすすんでいる。ただ、細胞の樹立等に時間を要し、また分化誘導についても長期にわたっており、課題を次年度に繰り越さざるを得なかった点があった。また、申請時の研究内容に加え、犬ALSモデルを利用しヒトへの応用研究にも着手しており、次年度は犬歯髄細胞の樹立・応用を計画している。
歯髄細胞からのiPS細胞の樹立、運動ニューロンへの分化誘導に加え、犬の歯より歯髄細胞を採取し、犬の歯髄細胞の樹立の安定した系を作成する予定である。犬モデルについては、将来的にはヒトへの応用を目指し、研究をすすめていく。

研究成果

• [雑誌論文] High frequency of calcification in basal ganglia on brain computed tomography images in Japanese older adults (2013)
  • 著者名/発表者名: Megumi Yamada, Asano T, Okamoto K, Hayashi Y, Kanematsu M, Hoshi H, Akaiwa Y, Shimohata T, Nishizawa M, Inuzuka T, Hozumi I
  • 雑誌名: Geriatr Gerontol Int 巻: 13 ページ: 706-710
  • DOI: 10.1111/ggi.12004
  • 査読あり
• [雑誌論文] Evaluation of SLC20A2 mutations that cause idiopathic basal ganglia calcification in Japan (2013)
  • 著者名/発表者名: Megumi Yamada, Masaki Tanaka, Mari Takagi, Seiju Kobayashi, Yoshiharu Taguchi, Shutaro Takashima, Kortaro Tanaka, Tetsuo Touge, Hiroyuki Hatsuta, Shigeo Murayama, Yuichi Hayashi, Masayuki Kaneko, Hiroyuki Ishiura, Jun Mitsui, Naoki Atsuta, Gen Sobue, Nobuyuki Shimozawa, Takashi Inuzuka, Shoji Tsuji, Isao Hozumi
  • 雑誌名: Neurology 巻: 82 ページ: 705-712
  • DOI: 10.1212/WNL.0000000000000143
  • 査読あり
• [学会発表] 頭部CT検査による海馬石灰化に関する臨床的検討 (2013)
  • 著者名/発表者名: 山田 恵、林 祐一、浅野隆彦、保住 功、犬塚 貴
  • 学会等名: 第54回日本神経学会学術大会
  • 発表場所: 東京国際フォーラム
  • 年月日: 20130529-20130601