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ParkinはE3の中でもRING-In-between-RNIG型スーパーファミリーに属しているが、昨年度は、ParkinがHECT型E3の特徴であるユビキチン(Ub)ーチオエステル中間体を形成するということを報告した。今年度は予定通り、Parkin C431Sの細胞内局在を調べるとともに、primary neuronでも中間体を形成するかを検討した。wt ParkinがCCCP処理にてミトコンドリアに移行するのに対し、Parkin C431SはCCCP処理1hr後はほぼ細胞質内に局在しており、3hr後も約25%程度しかミトコンドリアへの移行が見られなかった。更に、ミトコンドリアへの移行不全によるものか、基質であるMitofusinのユビキチン化も認めなかった。更に、primary neuronにレンチウイルスを用いてParkin C431Sを導入したものでもHela細胞と同様にUb-O-エステル中間体を形成することが確認された。ParkinのE3としての役割の全貌を明らかにするために実験をすすめていく上で、どの種類のE2がParkinのどの部位で結合するかを明らかにする必要性が生じた。HA-ParkinおよびFLAGで標識した多種類のE2を共発現し、HAでIPし、FLAGでWBを行ったところ、UbcH8がRING1 domainでParkinに結合することが明らかとなった。ParkinとUbcH8の結合はParkinにW403A変異 (結晶構造的にRING1 domainを覆い隠しているrepressor element of Parkinという領域) を導入することにより強まることも判明した。
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