| 研究課題/領域番号 |
25860959
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
石川 一志 大分大学, 医学部, 助教 (80600452)
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| 研究期間 (年度) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 分子生物学 |
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| 研究概要 |
エピプラキンは自己免疫性表皮下水疱症の自己抗原として同定されたプラキンファミリー分子の一つであるが、その動的機能を探るべく、エピプラキン欠損マウス（EPPK-/-）を作成した。皮膚の創傷治癒過程を電子顕微鏡で観察した結果、ケラチンの発現様式は野生型マウスと変わらなかったが、EPPK-/-では、ケラチン線維が細くなり、細胞全体にびまん性に分布する傾向を認めた。この結果、表皮細胞に機械的ストレスが加わる際、この分子はちょうど傘の骨格のようにケラチン線維を束ねて補強すると考えられた
個々の細胞ではエピプラキンは、中間径フィラメントと相互作用をしているが、三次元培養下での内腔形成のないHeLa 細胞塊では、その細胞塊の外側に、タイト・ジャンクションの一成分であるzonula occludens(ZO)-1 と共局在することが明らかになった。
本研究では、種々の系でのその確認と詳細な機序ならびに生物学的意義を解明したい。またエピプラキンは、プレクチン、プロフィラグリンと同様に多くの類似または同一ドメインが規則的に繰り返した構造をとっているが、その低分子化機構と、モノマーの機能は明らかでないため、それを明らかにしたい。本研究では、種々の系でのその確認と詳細な機序ならびに生物学的意義を解明したい。またエピプラキンは、プレクチン、プロフィラグリンと同様に多くの類似または同一ドメインが規則的に繰り返した構造をとっているが、その低分子化機構と、モノマーの機能は明らかでないため、それを明らかにしたい。
EPPK-/-の創傷辺縁部の表皮細胞では、細胞の遊走が早くなることが判明していたが、今回エピプラキンを発現低下させたHeLa 細胞でも、同様に細胞の遊走が早くなることが判明した。またHO 1-u-1細胞では低分子化が生じなかったが、表皮細胞では、免疫ブロット法で検討したところ、低分子化したバンドが認められた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
EPPK-/-表皮細胞の三次元培養シートの作成を試みたが成功しなかった。また
エピプラキン、タイト・ジャンクション分子の発現の観察を目的に、マトリゲルを用いて、内腔を有する三次元培養塊の作成を試みたが成功しなかった。
表皮抽出物について、抗体カラムを使用して、エピプラキン豊富画分を単離しようと試みたが、成功しなかった。抗体カラムの作成に問題があったと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
予定をやや変更して、下記の項目について重点的に研究を行う。
(1) EPPK-/-のバリア機能 1）出生時から、生後2 年程度まで、皮膚のバリア機能異常の有無を野生型と比較して追跡する。剃毛し、テープストリッピング後にTEW(transepidermal water loss)を測定する。2）同様にコルネオメーターを用い。角質水分量も測定する。3）テープストリッピング後、電顕で皮膚表面の異常を観察する。
(2) 培養表皮細胞では、エピプラキンの低分子化が認められたが、line化されたものではないため、他のline化された細胞での低分子化を検討する。
(3) エピプラキンとフィラグリンとの関連 1）フィラグリン欠損（flaky tail）マウスにおけるエピプラキンの発現と、エピプラキン欠損マウスにおけるフィラグリンの発現を、免疫染色と定量的RT-PCR 法で、定常状態と炎症状態において正常マウスと比較する。2）フィラグリン欠損マウスとエピプラキン欠損マウスを交配し、その表現型の差異を、定常状態と炎症状態において解析する。
(4) シグナル伝達経路とリン酸化について 1）EPPK-/-マウス、野生型マウスの表皮細胞または発現を低下させたHeLa 細胞で、Src-ERK 経路を中心にそのリン酸化を免疫ブロット法で調べる。2）上記経路の阻害剤（U0126 、PD98059）の効果で、確認する。3）上記経路を活性化させるsphingosylphosphorylcholine を投与し、確認する。
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