低分化型細胞株から独自方法で誘導した浮遊細胞塊の解析による癌幹細胞治療標的の検討

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 25861192
• 研究種目: 若手研究(B)
• 研究機関: 山口大学
• 研究代表者: 恒富 亮一 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (10420514)
• 研究期間 (年度): 2013-04-01 – 2016-03-31
• キーワード: がん幹細胞

研究概要

本研究は、予後不良な肝細胞癌を対象として、癌幹細胞 (CSC) を解析することで、肝内転移による再発の抑制に結びつける。癌幹細胞は転移や治療抵抗性に大きな役割を果たしていると考えられている。また、癌も可塑性を有し、上皮間葉系移行 (EMT) を介して癌細胞から癌幹細胞が発生しうることが報告されている。本研究では、高い転移・浸潤能を有する低分化型由来の細胞株から独自に誘導したCSC表現型を示す浮遊細胞塊 (Sphere) を誘導し、これを解析した。
低分化型及び未分化型肝細胞癌由来のSK-HEP-1及びHLEからSphere細胞 (SK-sphere及びHLE-sphere)を誘導することができた。一方、高分化型肝細胞癌由来のHuH-7及びHep 3BからはSphere細胞は誘導されなかった。肝転移モデルにおいて、SK-HEP-1に対してSK-sphereは肝転移の亢進が観察された。さらに、SK-sphereでのVimentin発現亢進が確認された。SK-sphere及びHLE-sphereは、それぞれの親株と比較して、5-FU、シスプラチンを含む種々の抗癌剤に対して有意に耐性を示した。しかしながら、ソラフェニブに対する耐性には有意な差は見られなかった。また、Sphere細胞におけるCD44 variant、HIF1alpha発現亢進、及び細胞内ROSレベルの低下が観察された。
さらに、SK-HEP-1及びSK-sphereにおけるmRNA、microRNA及びタンパク発現の網羅的解析を行い、それらを統合解析することで、CSCに関連する遺伝子、microRNA及びタンパクの候補を得た。
本研究から培養によって誘導された癌幹細胞様細胞は、転移能亢進と抗癌剤耐性を示し、EMTとROS除去系の亢進が示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

抗癌剤耐性機構に関する予備試験を全て本試験として完了した。CD133等の既知の肝細胞癌における癌幹細胞マーカーの発現解析を完了し、既知のCSCマーカーにおいてはCD44 variant発現が本研究の誘導CSCと関連することを明らかとした。また、新たなCSCマーカー及び治療標的の探索として、mRNAとmicroRNA発現の網羅的解析としてDNAチップ解析を完了し、タンパク発現の網羅的解析としてiTRAQ標識2D-LC-MS/MS解析を完了した。microRNAについては、加水分解プローブを用いてのreal-time PCR解析によるvalidationを経て、以後の解析の候補分子を確定した。エピジェネティック解析等、まだ完了していない解析もあるが、網羅的解析の統合解析から候補分子を同定するに至っており、概ね順調に進展している。

今後の研究の推進方策

新規CSCバイオマーカー (microRNA等) について、臨床血液サンプルを用いて予後 (術後再発) 予測マーカーとしての性能を検証する。上記、microRNAについて、候補microRNAの標的遺伝子をTargetScan等により検索し、mRNA発現データから検証を行い、Luc-3’-UTRアッセイを行うことで、標的遺伝子を同定する。また、同定されたmicroRNA及び標的遺伝子について、RNA干渉法による発現ノックダウンや発現ベクターによる強制発現系によってCSC様表現型への影響を主にマウス肝転移アッセイ、抗癌剤耐性アッセイ、Sphereアッセイによって検証し、転移・再発抑制のための核酸医薬への可能性を検討する。阻害剤やアゴニスト・アンタゴニストが存在する場合にはそれらを用いても検証を行う。標的遺伝子によっては癌免疫療法への可能性も検討する。

次年度の研究費の使用計画

予定していた網羅的解析の内、エピジェネティック解析にまで至らなかったため。
完了した網羅的解析から同定した候補microRNAの機能解析に係る経費 (microRNA mimic, microRNA inhibitor) に併せて使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Differences in UGT1A1, UGT1A7, and UGT1A9 Polymorphisms between Uzbek and Japanese Populations (2014)
  • 著者名/発表者名: Hiromichi Maeda, Shoichi Hazama, Abdiev Shavkat, Ken Okamoto, Koji Oba, Junichi Sakamoto, Kenichi Takahashi, Masaki Oka, Daisuke Nakamura, Ryouichi Tsunedomi, Naoko Okayama, Hideyuki Mishima, Michiya Kobayashi
  • 雑誌名: Molecular diagnosis & therapy 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] Expression of B7-H3, a Potential Factor of Tumor Immune Evasion in Combination with the Number of Regulatory T Cells, Affects Against Recurrence-Free Survival in Breast Cancer Patients (2014)
  • 著者名/発表者名: Noriko Maeda, Kiyoshi Yoshimura, Sigeru Yamamoto, Atsuo Kuramasu, Moeko Inoue, Nobuaki Suzuki, Yusaku Watanabe, Yoshinari Maeda, Ryoji Kamei, Ryouichi Tsunedomi, Yoshitaro Shindo, Makoto Inui, Koji Tamada, Shigefumi Yoshino, Shoichi Hazama, Masaaki Oka
  • 雑誌名: Annals of Surgical Oncology 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] A phase I study of combination vaccine treatment of five therapeutic epitope-peptides for metastatic colorectal cancer; safety, immunological response, and clinical outcome (2014)
  • 著者名/発表者名: Shoichi Hazama, Yusuke Nakamura, Hiroko Takenouchi, Nobuaki Suzuki, Ryouichi Tsunedomi, Yuka Inoue, Yoshihiro Tokuhisa, Norio Iizuka, Shigefumi Yoshino, Kazuyoshi Takeda, Hirokazu Shinozaki, Akira Kamiya, Hiroyuki Furukawa, Masaaki Oka
  • 雑誌名: Journal of Translational Medicine 巻: 12 ページ: 63
  • DOI: 10.1186/1479-5876-12-63
  • 査読あり
• [雑誌論文] UGT1A1*6, 1A7*3, and 1A9*22 genotypes predict severe neutropenia in FOLFIRI-treated metastatic colorectal cancer in two prospective studies in Japan (2013)
  • 著者名/発表者名: Shoichi Hazama, Ryouichi Tsunedomi, et al.
  • 雑誌名: Cancer Science 巻: 104 ページ: 1662-1669
  • DOI: 10.1111/cas.12283
  • 査読あり
• [学会発表] CANCER-STEM CELL-LIKE SPHERE CELLS INDUCED FROM A CELL LINE DERIVED FROM POORLY-DIFFERENTIATED HEPATOCELLULAR CARCINOMA EXERTS LIVER METASTATIC POTENTIAL AND CHEMORESISTANCE (2013)
  • 著者名/発表者名: Ryouichi Tsunedomi, Kiyoshi Yoshimura, Noriaki Hashimoto, Yusaku Watanabe, Masaaki Oka
  • 学会等名: 21st United European Gastroenterology Week
  • 発表場所: ICC Berlin, Berlin, The Federal Republic of GERMANY
  • 年月日: 20131016-20131016
• [学会発表] 抗癌剤耐性を示すヒト肝細胞癌細胞株から誘導した癌幹細胞様細胞 (2013)
  • 著者名/発表者名: 恒富 亮一、吉村 清、橋本 憲輝、渡邊 裕策、岡 正朗
  • 学会等名: 第21回日本消化器関連学会週間
  • 発表場所: グランドプリンスホテル新高輪、グランドプリンスホテル高輪、品川プリンスホテル (東京都)
  • 年月日: 20131011-20131011
• [学会発表] ヒト膵癌細胞株を用いた癌幹細胞が豊富な細胞集団の誘導 (2013)
  • 著者名/発表者名: 吉村 清、渡邊 裕策、恒富 亮一、新藤 芳太郎、前田 祥成、松井 洋人、前田 訓子、橋本 憲輝、鈴木 伸明、上野 富雄、山本 滋、吉野 茂文、硲 彰一、岡 正朗
  • 学会等名: 第21回日本消化器関連学会週間
  • 発表場所: グランドプリンスホテル新高輪、グランドプリンスホテル高輪、品川プリンスホテル (東京都)
  • 年月日: 20131011-20131011
• [学会発表] 肝細胞癌におけるMCM6の発現とその意義 (2013)
  • 著者名/発表者名: 飯田 通久、恒富 亮一、徳久 善弘、坂本 和彦、為佐 卓夫、上野 富雄、吉野 茂文、硲 彰一、岡 正朗
  • 学会等名: 第21回日本消化器関連学会週間
  • 発表場所: グランドプリンスホテル新高輪、グランドプリンスホテル高輪、品川プリンスホテル (東京都)
  • 年月日: 20131011-20131011
• [学会発表] Overexpression of MCM6 is associated with poor prognosis of hepatocellular carcinoma (2013)
  • 著者名/発表者名: Michihisa Iida, Norio Iizuak, Ryouichi Tsunedomi, Kazuhiko Sakamoto, Takao Tamesa, Shoichi Hazama, Masaaki Oka
  • 学会等名: 第72回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 (神奈川県)
  • 年月日: 20131005-20131005
• [学会発表] Chemoresistance of induced cancer-stem cell-like sphere cells from a human hepatocellular carcinoma cell line (2013)
  • 著者名/発表者名: Ryouichi Tsunedomi, Kiyoshi Yoshimura, Masaaki Oka
  • 学会等名: 第72回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 (神奈川県)
  • 年月日: 20131004-20131004
• [学会発表] Expressions of ULBP1 and NKG2D are related to their clinicopathological outcome in patients with gastric cancer (2013)
  • 著者名/発表者名: Kiyoshi Yoshimura, Ryoji Kamei, Nobuaki Suzuki, Ryouichi Tsunedomi, Noriko Maeda, Yusaku Watanabe, Yoshinari Maeda, Shigeru Takeda, Tomio Ueno, Shigeru Yamamoto, Shigefumi Yoshino, Shoichi Hazama, Masaaki Oka
  • 学会等名: 第72回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 (神奈川県)
  • 年月日: 20131004-20131004
• [学会発表] Cancer stem like cells induced from human pancreatic cancer cell lines have epithelial-mesenchymal transition property (2013)
  • 著者名/発表者名: Yusaku Watanabe, Kiyoshi Yoshimura, Yoshitaro Shindo, Yoshinari Maeda, Ryouichi Tsunedomi, Nobuaki Suzuki, Tomio Ueno, Shigefumi Yoshino, Shoichi Hazama, Masaaki Oka
  • 学会等名: 第72回日本癌学会学術総会
  • 発表場所: パシフィコ横浜 (神奈川県)
  • 年月日: 20131003-20131003
• [学会発表] ヒト肝細胞癌細胞株から誘導した癌幹細胞様細胞の抗癌剤耐性 (2013)
  • 著者名/発表者名: 恒富 亮一、吉村 清、橋本 憲輝、渡邊 裕策、岡 正朗
  • 学会等名: 第24回日本消化器癌発生学会総会
  • 発表場所: 石川県立音楽堂 (石川県)
  • 年月日: 20130906-20130906
• [学会発表] ヒト膵癌幹細胞からの癌幹細胞の培養による誘導 (2013)
  • 著者名/発表者名: 吉村 清、渡邊 裕策、倉増 敦朗、井上 萌子、恒富 亮一、新藤 芳太郎、亀井 滝士、前田 訓子、前田 祥成、飯田 道久、鈴木 伸明、上野 富雄、山本 滋、吉野 茂文、硲 彰一、玉田 耕治、岡 正朗
  • 学会等名: 第17回日本がん免疫学会総会
  • 発表場所: ANAクラウンプラザホテル宇部 (山口県)
  • 年月日: 20130705-20130705
• [学会発表] ヒト膵癌幹細胞を用いた癌幹細胞richな細胞集団の誘導とその培養液中のサイトカインの検索 (2013)
  • 著者名/発表者名: 渡邊 裕策、吉村 清、新藤 芳太郎、橋本 憲輝、恒富 亮一、前田 祥成、鈴木 伸明、上野 富雄、吉野 茂文、硲 彰一、岡 正朗
  • 学会等名: 第17回日本がん免疫学会総会
  • 発表場所: ANAクラウンプラザホテル宇部 (山口県)
  • 年月日: 20130704-20130704
• [学会発表] 低分化型肝細胞癌株から誘導された癌幹細胞様細胞の解析 (2013)
  • 著者名/発表者名: 橋本 憲輝、恒富 亮一、吉村 清、渡邊 裕策、岡 正朗
  • 学会等名: 第17回日本がん免疫学会総会
  • 発表場所: ANAクラウンプラザホテル宇部 (山口県)
  • 年月日: 20130704-20130704
• [学会発表] 2つのトランスクリプトーム解析からのHCV関連肝細胞癌予後予測 (2013)
  • 著者名/発表者名: 恒富 亮一、飯塚 徳男、飯田 通久、筒井 理仁、兼清 信介、坂本 和彦、為佐 卓夫、岡 正朗
  • 学会等名: 第113回日本外科学会定期学術集会
  • 発表場所: 福岡国際会議場、福岡サンパレス、マリンメッセ福岡(福岡県)
  • 年月日: 20130411-20130411
• [学会発表] ヒト膵癌幹細胞における微小周辺環境の探索 (2013)
  • 著者名/発表者名: 吉村 清、渡邊 裕策、恒富 亮一、新藤 芳太郎、亀井 滝士、前田 訓子、前田 祥成、飯田 道久、鈴木 伸明、上野 富雄、山本 滋、吉野 茂文、硲 彰一、岡 正朗
  • 学会等名: 第113回日本外科学会定期学術集会
  • 発表場所: 福岡国際会議場、福岡サンパレス、マリンメッセ福岡(福岡県)
  • 年月日: 20130411-20130411
• [学会発表] HCV陽性肝細胞癌におけるMCM6発現の意義 (2013)
  • 著者名/発表者名: 飯田 通久、徳光 幸夫、橋本 憲輝、前田 祥成、徳久 善弘、恒富 亮一、坂本 和彦、為佐 卓夫、飯塚 徳男、岡 正朗
  • 学会等名: 第113回日本外科学会定期学術集会
  • 発表場所: 福岡国際会議場、福岡サンパレス、マリンメッセ福岡(福岡県)
  • 年月日: 20130411-20130411